流式细胞术分析及应用.ppt

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1、1流式细胞术分析及应用2流式细胞术的原理流式细胞术的应用流式细胞术的数据处理流式细胞术的样品制备主要内容流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。3一、流式细胞术的原理现代流式细胞仪包括液流系统聚焦细胞以供检测光学系统激发和收集光信号电子系统将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析4液流系统液流系

2、统将样本悬液聚焦在光源的中心处5SampleFlowinOpticalCuvette6SampleLaminarFlowLowSampleFlowRate12mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOpticalCuvetteHighSampleFlowRate60mL/min样品和鞘液流78InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式细胞仪的光学系统激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。激光波

3、长:台式机为固定波长488nm,635nm，大型机波长谱线宽包括325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647nm光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产生的光信号引导至检测器。9流式细胞仪的光信号散射光信号荧光信号10111.散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光——FSC12FALSSensorLaser侧向角散射光——SSC1

4、3FALSSensor90LSSensorLaser散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异-通常使用“散点图”来看散射光信号-散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据14散点图——DotPlot15lysedwholeblood2.荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强16Fluorochromespecification1718Compensation二、流式细胞术的应用细胞表型分析胞内蛋白的检测细胞周期分析细胞因子测定分选细

5、胞内钙离子测量……191.细胞表型分析20212.胞内蛋白的检测223.细胞周期的检测23CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）244.细胞凋亡的检测25261、荧光信号的面积：对荧光光通量进行积分2、DNA指数(DI)：相对DNA含量=样品G0/G1细胞DNA含量平均数标准二倍体DNA量的平均数3、异倍体：非二倍体，包括近二倍体、四倍体、多倍体、非整倍体凋亡细胞的特点在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。细胞坏死时

6、，细胞肿胀，FSC增大，SSC也增大27AnnexinVAssay2829AnnexinV/PI双染活细胞为（AnnexinV-/PI-）坏死细胞为（AnnexinV+/PI+）凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）AnnexinVAssay----能够区分死亡与凋亡30315、细胞因子测定++Antigen(cytokines)FluorescenceDetectorantibodyCapturebeadsCaptureantibodyBeads32BeadsProvideaFlexiblePlatformMultiplesizesBeadsprovideane

7、xpandableassayplatformforusewithaflowcytometerDifferentintensitiesDifferentcolorswithdifferentintensities33MultiplexedBeadsShadesofacolorAntibodycoupledbeads,emittingatdistinctFL3intensitiesVariousanalytesAntibodycoupledPElabel,emittingatFL2intensityproportionaltoanalyteconc.34Example

8、6-bea