流式细胞术实验方法及应用ppt课件

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1、流式细胞术实验方法及应用科研型分选功能488nm激光四色荧光(525、575、610、675nm）一、流式细胞术的原理流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。前向散射激光FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管近30年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞

2、生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个细胞，甚至几万个细胞。多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把细胞群分为各亚群。二、流式细胞术的特点、优点定性、定量分析细胞通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。灵敏度高荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于<600个(如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um颗粒。分选感兴趣的细胞纯度达99%，收获率可达90%。流式细胞术的应用范围细胞大小细胞表面分子:CD系

3、列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度常用荧光素激发光波长（nm）发射波长(nm)异硫氰酸（FITC）488525（绿）藻红蛋白（PE）488575（橙）碘化丙啶（PI）488610（红）藻红蛋白偶联物（PE-CY5）488667（红）藻红蛋白偶联物（PE-CY7）488767（红外）别藻青蛋白（APC）633660（红）别藻青蛋白偶联物（APC-CY7）633767（红外）三、单克隆抗体标记荧光探针选择1.了解激发光波长和发射波长2.要有高的光子产量---提高信号强度。

4、3.对激光有强的吸收----降低背景噪音。4.激发光谱和发射光谱之间差距大---减少干扰。5.易与被标记的物质结合，而不影响被标记物的特异性。6.稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂等影响。细胞表型分析：双色分析：FITC与PE三色分析：双色分析+PE-CY5四色分析：三色分析+ECDDNA含量分析：PI凋亡与坏死分析：凋亡用AnnexinV-FITC/PI双染常用荧光探针组合四、标本的收集、单细胞悬液的制备骨髓、外周血、细胞株、组织器官、胸水、腹水、尿液脱落细胞等1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标

5、记，再溶血。单细胞的分离制备分离液血液+生理盐水离心2500r/min，20-30min单个核细胞单核细胞:利用单核细胞在短时培养贴壁快的特性（30-40min），可采用短时培养获得较纯的单核细胞.2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)培养板吸去培养液PBS洗2次胰蛋白酶37℃，室温，3-5min含血清的培养基吹打PBS洗2次单细胞悬液。3.组织器官单细胞悬液的制备酶消化法组织器官单细胞制备仪剪碎法机械法网搓法研磨法（1）、酶消化法组织块洗去血液剪成小块胰蛋白酶37℃，15-30min含血清的培养基100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/m

6、in，5minPBS洗2次单细胞悬液。（2）、机械法单细胞制备仪组织块洗去血液剪成小块制备仪2-3min100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。剪碎法组织块洗去血液剪至浆状吸管轻轻吹打100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。网搓法组织块洗去血液100目钢筛网轻搓生理盐水收集滤液300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。研磨法组织块洗去血液研磨器研至匀浆100目钢筛网300目尼龙网过滤离心1000r/min，5min

7、PBS洗2次单细胞悬液。4.石蜡包埋组织单细胞悬液的制备醇乙脱水：70％→80%→90％→95%→100%醇乙→二甲苯→石蜡包埋脱蜡水化：二甲苯脱蜡→100％醇乙→90%→80%→70％→50％→蒸馏水手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。石蜡包埋组织制备单细胞悬液石蜡包埋组织切片二甲苯脱蜡1-2天水化乙醇，蒸馏水组织器官胰蛋白酶37℃，15-30min冰PBS100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液5.脱落细胞单细胞悬液的制备包括：尿液脱落细胞胸水、腹水

8、脱落细胞冲洗液脱落细胞收集胸水、腹水、尿液、冲洗液置4℃冰箱中沉淀取底部10-20mlPBS洗3次300目尼龙滤网过滤单细