流式细胞术实验方法

流式细胞术实验方法

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时间:2018-01-20

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1、流式细胞术实验方法PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm,5min,弃上清液。2、加入PBS1ml离心洗涤1次,弃上清。3、加入2ml预冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定过夜。4、离心,弃上清液。5、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。6、加入RNaseA(工作浓度20ug/ml)于500ul1×PBS中,37℃孵育30min,离心。7、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。8、加入PI(工作浓度50ug/ml)于500ul1×PBS中,室温避光孵育30min。9、混匀,过300目筛网,置流式管中,4℃冰箱保存,待测。GFPPI

2、染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm,5min,弃上清液。2、加入PBS1ml离心洗涤1次,弃上清。3、加入2ml预冷PFA,PFA的浓度根据细胞的特点进行调节,4℃固定30min。以下步骤同PI染色操作步骤的(4-9)细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm,5min,弃上清液。2、以冷PBA1ml,离心洗涤,弃上清液。3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min-1h。4、离心弃上清液。5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次,以除去

3、未结合的多余抗体成分。6、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀,置流式管中,4℃避光保存,待测。细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul,对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心,弃上清。4、BS1ml离心洗涤1次,以去除多余的未结合的特异性抗体。5、PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,避光。6、PBS1ml离心洗涤2次。7、将细胞重新悬浮于500ulPBS中,混匀,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待测。胞

4、内直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm,5min,弃上清液。2、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。3、4%PFA1ml,4℃固定30min。4、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。5、0、1%Triton-1001ml,室温10min。6、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。7、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul,用微量移液器轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min-1h。8、离心弃上清液。9、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次,以除去未结合的多余抗体成分。10、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀,置流式管中,4℃避光保

5、存,待测。胞内间接免疫荧光染色操作步骤1-6、同胞内直接免疫荧光染色操作步骤7、加入用PBA稀释的第一抗体200ul,对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心,弃上清。8、冷PBS1ml离心洗涤1次,以去除多余的未结合的特异性抗体。9、加入PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,避光。10、冷PBA1ml离心洗涤2次。11、将细胞重新悬浮于500ulPBS中,混匀,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待测。备注:1、RNaseA:贮液浓度:1mg/ml;工作液配制:加1mg/ml贮液10

6、ul于500ul1×PBS中,使终浓度为20ug/ml。2、PI:贮液浓度:2、5mg/ml;工作液配制:加2、5mg/ml贮液10ul于500ul1×PBS中,使终浓度为50ug/ml。3、PBA:即PBS加1-2%牛血清白蛋白,加0、1%叠氮钠。4、检测样品细胞浓度1x106/ml。

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