地黄多糖对大鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞诱导分化影响的研究

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1、中国人民解放军军医进修学院；中国人民解放军总医院硕士学位论文地黄多糖对大鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞诱导分化影响的研究姓名：张琰琴中请学位级别：硕士专业：内科学（心血管）指导教师：陈光辉20080526地黄多糖对脂肪间充质干细胞向心肌细胞诱导分化影响的研究中文摘要背景：脂肪间充质干细胞(ADMSCs)是从脂肪组织中分离得到的间充质干细胞，是成体干细胞的一种.近年来大量研究证明ADMSCs与其它千细胞一样既具有很强的自我更新能力，又具有多向分化的潜能。但由于ADMSCs来源充足、取材方便、给患者带来的痛苦较小，同时又可以避免伦理学等问题

2、，所以ADMSCs逐渐成为千细胞治疗领域的一个新的焦点.近年来，随着人们生活水平的提高，心血管疾病的发病率逐年升高，已经成为威胁人类健康的主要疾病，特别是急性心肌梗死、心梗后心衰等疾病具有很高的病死率和致残率.这是因为成熟心肌细胞属于终末分化细胞，缺乏再生能力，所以一旦心肌细胞受到不可逆损伤时，心肌细胞数量减少，纤维瘢痕组织增生替代，最终发展成为心力衰竭.多年来临床工作者不断致力于心肌梗死后心肌保护和梗死后心衰预防及治疗的研究.目前最有效的方法就是尽快实现心肌的再灌注，目的是保护和扌免救存活的心肌细胞，从而保护心功能.再灌注疗法确实能

3、够降低上述疾病的死亡率，但由于受到很多因素的影响，再灌注保护和挽救心肌细胞的作用有限.ADMSCs由于具有多向分化潜能，成功诱导ADMSCs向心肌细胞方向分化，实现心肌细胞的再生及替代，自然成了解决这卜难题的新思路.目前国内外已经有大量研究发现，ADMSCs能够成功分化为心肌细胞，甚至观察到了自主跳动心肌细胞的产生；在体的动物实验发现ADMSCs移植后具有减小心肌梗死面积，改善心功能的作用.这些研究发现极大的鼓舞了世界各地的科研工作者.但由于ADMSCs研究尚处于起始阶段，在实际应用中还有许多问题需要进一步研究，比如怎样增强ADMSC

4、s在体外培养的增殖能力，从而既实现ADMSCs在体外大量扩增，又不影响其分化能力；ADMSCs移植到体内或梗死区后能否继续存活，怎样提高移植细胞在梗死区的存活率；如何提高ADMSCs向心肌细胞的转化率等.这些问题的解决对ADMSCs尽快应用到临床具有十分重要的意义.地黄多糖是中药地黄的主要有效成分，从地黄的根茎中提取.研究发现地黄多糖可以明显促进正常小鼠骨髓造血干细胞的增殖，对粒单系祖细胞和早、晚期红系祖细胞的增殖和分化亦有明显促进作用.地黄提取物还可以不同程度的对抗肝微粒体脂质过氧化，从而降低组织的过氧化脂质水平•，此外地黄多糖还具

5、有增强免疫力、抗衰老.保护心.脑.肾脏和胃黏膜等多种生物学功能.传统医学博大精深，并且拥有丰富的中医药材.本实脸用地黄多糖作用于ADMSCs,旨在将祖国的传统医学与ADMSCs研究相结合，探索新的研究思路，帚望能够给ADMSCs研究带来新的突破，为ADMSCs早日应用到临床提供实验依据.目的：①分离、培养大鼠ADMSCs,观察地黄多糖对ADMSCs在体外培养时增殖能力和生物学性状的影响；②用FLO?作用于ADMSCs,模拟ADMSCs移植到心肌梗死区的损伤，观察地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs的保护作用；③观察地黄多糖对ADMSCs

6、在体外经5-氮胞著(5-aza)诱导后向心肌细胞转化率的影响。内容和方法：根据以上目的，本研究分成三个部分：第一部分取体重约200g的Wistar雄性大鼠，在无菌条件下分离培养ADMSCs,对第3代细胞行免疫组织化学染色，鉴定其表面分子CD13、CD31、CD44、CD45.CD105等的表达。取第3代细胞用不同浓度地黄多糖干预，MTT法绘制细胞生长曲线；消化计数法测定不同时间点的细胞贴璧率；免疫组织化学染色鉴定其表面分子.第二部分同样方法获取ADMSCs。取第3代ADMSCs,随机分为6组，I：H2O2损伤组；A、B、C、D分别为H

7、2O2损伤加地黄多糖各浓度作用组(1mg/L.50mg/L.100mg/L.200oig/L);N：正常对照组，对应于分组，症入不同浓度地黄多糖培养24h,加250umol/L过氧化氢(H2O2)作用2h,诱导ADMSCs损伤，然后用MTT法检测细胞存活情况，比色法检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的水平.第三部分同样方法获取ADMSCs.取第3代ADMSCs,采用浓度为10umol/L的5-氮胞菩诱导24小时，之后分为A、B两组(A:对照组；B：浓度为200mg/L的地黄多糖干预组)继续培养4周，免疫组化染色法鉴定a-actin

8、的表达，流式细胞仪检测各组ADMSCs向心肌细胞的转化率.结果：大鼠附睾处脂肪组织中含有大量ADMSCs,呈长梭形贴壁生长，免疫化学染色鉴定CD13、CD44、CD105阳性，CD31、CD45阴性;第3代ADMSCs具