5 氮胞苷诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化成肌细胞

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1、5氮胞苷诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化成肌细胞【摘要】目的：观察并检测5氮胞苷（5Aza）诱导大鼠脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化成肌细胞的过程中，细胞形态及相关基因、蛋白的表达情况，探讨5Aza对大鼠AMSCs分化的诱导作用.方法：分离大鼠AMSCs，在含有10μmol/L5Aza的培养液中培养，观察细胞形态的变化，并通过逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测诱导后MyoG的表达，免疫细胞化学染色法检测诱导后Desmin和αSaretricActin的表达.结果：用10μmol/L5Aza诱导后，细胞形态逐渐伸展变长，呈现肌细胞形态；RTPCR结果显示，诱导后15h左右开始

2、表达MyoG；免疫细胞化学染色结果显示，诱导10d后Desmin染色呈弱阳性，14d阳性程度增强，且此时部分细胞开始表达αsarericActin，并随时间延长表达增强，至28d呈强阳性.结论：采用10μmol/L5Aza可以诱导大鼠AMSCs向肌细胞分化.【关键词】5氮胞苷脂肪间充质干细胞肌细胞0引言　　脂肪间充质干细胞(adiposetissuederivedmesenchymalstemcells,AMSCs)是继骨髓间充质细胞后发现的又一具有广阔应用前景的成体干细胞.自2001年以来，国内外多个研究小组从不同物种分离出AMSCs［1-2］，并相继证实它具有向脂肪细胞、软骨细胞、

3、成骨细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经细胞和内皮样细胞等多种细胞分化的能力［1-5］.AMSCs可作为多种组织工程的种子细胞，为研究细胞定向分化提供了一个新的工具，其定向分化成肌细胞在有关肌损伤的治疗上具有重要的现实意义.我们采用含有10μmol/L5Aza的培养液体外诱导大鼠AMSCs分化成肌，以期为AMSCs的应用提供理论依据.1材料和方法1.1材料DMEM培养基（Gibco），I型胶原酶（Sigma），胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（杭州四季青），TripureIsolationReagent（RocheSAb（北京中杉金桥生物技术有限公司），小鼠抗大鼠DesminmAb,小鼠抗大鼠α

4、SaretricActinmAb,SABC试剂盒及DAB显色剂（武汉博士德），20日龄雄性SD大鼠购于第四军医大学实验动物中心.1.2方法1.2.1大鼠AMSCs的分离培养根据本实验室建立的方法［6］，将大鼠断颈处死，并充分浸泡于750mL/L乙醇中消毒10min，取出，无菌条件下取脂肪垫，用含高浓度抗生素(青霉素3×105U/L和链霉素3×105U/L)的无血清培养基溶液清洗三次，将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，加入5g/LI型胶原酶，置于恒温水浴振荡器中37℃振荡消化50min，取出，加入与胶原酶等体积的含血清培养基中和消化，将组织悬液依次通过160目和600目筛网过滤，收集滤

5、液，1300r/min离心5min，弃上清，加入红细胞裂解液重悬细胞，室温静置10min,1300r/min离心5min，弃上清，加入无血清培养基重悬细胞，1500r/min离心5min，弃上清，向离心管内沉淀中加入含100mL/LFBS的DMEM培养基，5×104/cm2密度接种.37℃50mL/LCO2培养箱中培养，24h后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每隔48h换液1次.待细胞增殖至皿底面90%融合，用2.5g/L胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代.1.2.2大鼠AMSCs鉴定选择生长良好的第五代细胞，用40mL/L甲醛固定30min，参照SABC试剂盒和DAB染色剂说明进行抗CD34,CD

6、44,CD105,CD106和HLADR免疫细胞化学染色.倒置显微镜观察并照相.1.2.35Aza（10μmol/L）诱导AMSCs成肌分化向DMEM完全培养基中加入5Aza至终浓度为10μmol/L并使之完全溶解，配制成诱导培养基.取传至第四代AMSCs，向培养皿内加入诱导培养基，24h后去除诱导培养基，1×PBS洗涤2遍后更换DMEM完全培养基继续培养，每2d换液1次.1.2.4RTPCR检测MyoG的表达RTPCR分别检测未诱导及诱导后12,15,24,48和72hMyoG的表达.RNA提取和逆转录反应常规进行.RTPCR用两步法试剂盒，按操作程序进行，PCR反应条件为：94

7、℃1min，59℃1min，72℃1min，共33循环，最后72℃延伸10min.MyoG上游引物：5′CTACAGGCCTTGCTCAGCTC3′，下游引物：5′ACGATGGACGTAAGGGAGTG3′，引物扩增片段为221bp；βactin上游引物：5′ACTGCCGCATCCTCTTCCTC3′，下游引物：5′CTCCTGCTTGCTGATCCACATC3′，引物扩增片