单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断

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1、单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断文章来源：国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第1期发表时间：2004-08-1013:25:00关键字：单链抗体；表达；肿瘤诊断；肿瘤治疗自从1975年K?hler和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术以来，单克隆抗体技术在临床诊断和基础研究中的应用越来越广泛，但在疾病治疗方面,还没有达到令人满意的效果，原因主要是应用的单克隆抗体绝大多数来自鼠类，而鼠抗体在人体内应用时容易产生人抗小鼠lg抗体而降低疗效，而人源性抗体制备尚存在许多困难。1988年以来，抗体基因工程的研

2、究取得了一些技术上的进展。Huston等⑴和Bird等利用基因工程技术成功制备了单链抗体(SinglechainFv,scFv或singlechainantigenbindingprotein,SCA),scFv是由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片断，大小为完整抗体的六分之一，分子量约为27KD。它具有许多优点：①分子小，免疫原性低，用于人体不易产生抗异种蛋白反应；②容易进入实体瘤周围的微循环；③血循环和全身廓清快，半衰期短，肾

3、脏蓄积很少；④无Fc段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，成像清晰；⑤易于基因操作和基因工程大量生产。此外单链抗体还可以与毒素、前体药物转化酶、放射性同位素、细胞因子等效应分了构建成多种双功能抗体分了，单链抗体也是构建双特异性抗体的理想元件，用于肿瘤的临床诊断和治疗显示出了巨大的潜力，目前国外的一些抗肿瘤单链抗体已进入体内试验阶段。1单链抗体的构建基因工程单链抗体技术的基本原理是：首先从杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞中提纯mRNA,再经RT-PCR分别扩增抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因，人工合成一条寡核昔酸序列（

4、称为Linker）,将VL的C端与VL的N端或VH的C端与VL的N端相连接，构建成单链抗体基因，在一定的表达系统中得以表达。人工合成的寡核昔酸Linker序列，在单链抗体的构建中十分重要，Linker必须能使重、轻链可变区口由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并不引起分子动力学改变，目前使用最多的Linker序列是Huston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构的15肽序列（Gly4Ser）3［1］,许多研究者应用此序列构建单链抗体基因并表达岀活性产物。单链抗体的C末端可以引入半胱氨酸尾［2］、酪蛋白激酶底物尾［2

5、］、E尾等结构，有助于标记和偶联其它分子，也可以引入钙调蛋白尾［2］、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾⑶、脂类标签、组氨酸尾等，使表达产物易于检测和纯化。2单链抗体的表达系统2.1细菌目前，大多数单链抗休都在E.coli中表达。E.coli易于操作,转化和转导效率高，生长迅速，可以快速大规模地生产抗体蛋白。E.coli表达单链抗体主要有两种方式：①表达产物以包涵体形式存在于菌体内，这种方法简单，不需要信号肽，但产生的蛋白常常没有活性，经过体外溶解、复性、重新折叠、色谱纯化等许多步骤，才可能获得有活性的单链抗体。②分泌

6、表达具有功能的单链抗体至细胞周质中，它避免了表达后蛋白复性的许多麻烦，近年来单链抗体的表达主要采用分泌表达方式，将引导分泌表达的信号肽OmpA>PelB>phoA等基因与单链抗体基因相连接，使表达产物分泌到细胞周质或培养上清中，获得有活性的可溶性表达产物。Kipriyanov等[4]发现，在培养基中加入终浓度为0.4M的蔗糖，可使可溶性的单链抗体产量提高15〜150倍。Naveen等发现，VL和VH功能域的先后顺序对单链抗体的分泌水平影响很大oVL-VH结构的分泌产量是VL・VH结构产量的20倍。另外，轻链部分在免

7、疫球蛋白分子的分泌调节屮起重耍作用，单独的轻链可以稳定分泌，单独重链则很难分泌，推测机理可能是：VH的折叠占据了VL的空缺部位，导致包涵体形成，影响了分泌量。随着研究的深入，人们发现利用E.coli表达抗体具有一定的局限性，因为E.coli不能对重组抗体进行翻译后糖基化修饰，但目前尚没冇证据表明糖基化与抗原结合能力有直接关系。2.2真核细胞真核细胞具有一套完整的合成、组装和分泌蛋白质的细胞装置，因此产生的抗体分子与天然蛋白质一样能形成链间和链内二硫键,维持正确的蛋白构象以及翻译后糖基化加工，并分泌到细胞外，成为功能

8、性抗体分子。目前用于表达单链抗体的真核细胞有：酵母、昆虫细胞、cos细胞、CHO细胞等。Carolina等用乳腺细胞(COS-7)表达单链抗体，分泌表达的单链抗体至少90%以上具有功能性。目前用乳腺细胞表达单链抗体应用较多。Eldin等⑸用酵母分泌表达了两种不同的单链抗体，最高水平达到250mg/L,与E.coli表达的相同单链抗体比较，抗原亲和力没有改变，