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《抗CD47单抗对人树突状细胞的免疫调控作用及其机制探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、［文章编号］1000-4718(2004)12-2248-05抗CD47单抗对人树突状细胞的免疫调控作用及其机制探讨*俞静，林茂芳，牟海波，黄河，蔡真（浙江大学医学院附属笫一医院血液科，浙江杭州310003）［摘要］目的:研究可溶性的抗CD47单抗（B6II12）对树突状细胞（DC）的免疫调控作用及分子机理。方法:分离人外周血单核细胞，联合应丿UrhGM-CSF.IL-4、细菌脂多糖（LPS）在体外诱导扩增DC,并在培养体系中添加抗CD47单抗（B6H12）。采用透射电镜观察DC形态，流式细胞仪检测DC膜表而分子，ELISA定量检测DC释放【-12P70水
2、平,Br（lu-ELISA法检测DC刺激同种异型淋巴细胞增殖，凝胶电泳迁移率改变实验（BISA）检测NF-KB活性。结果：（1）经抗CD47单抗（B&I⑵处理的DC,膜表而CD80、CD86、CDlu、CD83、DR表达显著降低（Pv（105）;其释放IL-12P70的水平及刺激同种异型淋巴细胞增殖的能力也显著低于对照组（PvQOl）。（2）B6H12单抗处理DC组其NF-KB活性显苦降低（PvQ05）,.ft该效应呈剂量依赖性。结论：抗CIM7单抗可通过抑制NF-KB活性而影响DC的发育、成熟及功能。［关键词］树突细胞；免疫耐受；NF-KB［中图分类号］
3、R363［文献标识码］A树突状细胞（Dendriticcell,DC）是重要的专职抗原提呈细胞•在免疫应答屮起关键的引导和调节作用,其成熟程度是引发T细胞依赖性免疫应答所必需。因此,探讨与DC相关的免疫耐受机理以及应用未成熟DC诱导供者特异性免疫耐受已成为移植研究领域的热点之一。核转录因子（NF-KB）是与DC成熟、激活及存活密切相关的转录因子I多种免疫抑制剂乃通过调节NF-KB而发挥免疫抑制作用⑺。整合素相关蛋口（CD47）属免疫球蛋口超家族的一员，与其配体相互作用可参与机体的免疫负调节⑴o为探讨CD47对DC的免疫调节作用及其机制，木研究应用抗CD4
4、7单抗B6H12研究CD47在免疫耐受诱导中的作用及对NF-KB活性的影响。材料和方法1主要试剂rhGM-CSF（ScheringPlough公司）,IL-4（Peprcrtech公司），细菌脂多糖（LPS,Sigma公司），淋巴细胞分离液（屮国医学科学院血液学研究所，密度1.0）7±0.002）,鼠抗人CD47单抗（B6H12）及Ig（；l型同型［收稿日期］2004-03-10［修回日期］2004-06-03水［基金项目］国家口然科学基金资助项tl（No.30270571）;教育部博士点专项基金项目（No.20020335080）TekO彳勢4赵刚隨右恥
5、耗砌硕!述魏闻1^fectronic对照单抗（Pharmingen公司）,荧光标记的鼠抗人CD80-PE>CD86-FrTC>CDla-PE、CD83-FTTC、DR-PE以及相应同型对照抗体（Calt笔公司）,IL-12P70ELIS4试剂盒（Bender公司），BduELISA试剂盒（Roche公口］）,GelShiftAssaySystem试剂盒（Pnxnega公创）。2树突状细胞的体外培养及扩增取新鲜分离的健康成人白细胞悬液，以淋巴细胞分层液（Ficoll）分离单个核细胞,PBS洗涤细胞3次后加RPM1-1640培养液，接种于24孔培养板，1mL/
6、w（dl（细胞密度为2x109/L-4xlO^/L）,置37°C、5%C（）2培养箱内2h,弄上清，用RPMI-1640培养液洗2-3次。获得贴壁细胞，以流式细胞仪（EPICS-XL型，BeckmanCoulter公司）检测.CD14+细胞占92.7%o于每孔加入1mL完全培养液（含rh（；M-C迈lx10忙/L、IL-45x10?U/L）,37°C.5%（I）2>饱和湿度条件下培养3（1,以该完全培养液半量换液1次。在6（1,收集非贴壁细胞，调整细胞密度为1x109cells/L,接种于24孔培养板中,每孔1mL;其中一部分细胞再添加含LPS1mg/L的
7、RPMI-1640培养液，继续培养3山收集细胞。3实验分组及细胞处理共分3组，分别是①^加B6H12处理组：DC培培养5(I后同时加用LPS及同型对照单-抗；③CIM7单抗B6H12处理组：DC培养5(1后同时加LPS及B6H12单抗。各实验组于LPS作用2h后收集一部分细胞供提取核蛋白及凝胶电泳迁移率改变实验(EMSA);于LPS作用48h后收集一部分细胞行流式细胞仪检测。4DC形态学鉴定将培养的DC置光学显微镜下动态观察。培养5(1>10(1的DC进行电镜分析，将DC悬液用0.01mol/L(
8、>H7.4)PBS洗涤后，1000r/min离心5rnin
9、,4%戊二醛固定,PBS洗涤，制片，1%饿酸固定，梯度乙醇脱水，透
