鸡病毒性呼吸道病检测方法的建立_管理学_高等教育_教育专区

《鸡病毒性呼吸道病检测方法的建立_管理学_高等教育_教育专区》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY硕士学位论文MASTERSDEGREEDISSERTATION鸡病毒性呼吸道病原多重RT-PCR检测方法的建立AMULTIPLEXRT-PCRASSAYFORSEVERALRESPIRATORYVIRUSESINCHICKENPATHOGENS研究生：姚蓉CANDIDATE：RONGYAO导师：毕丁仁教授SUPERVISOR：PROFESSORDINGRENBIMAJOR：PREVENTIVEVETERINARYMEDICINE研究方向：兽医微生物与免疫学FIELD：VETERINARYMICROBIO

2、LOGYANDIMMUNOLOGY专业:预防兽医学==

3、Wi中国武汉WUHAN,CHINA二O—二年六月JUNE,2012分类号密级华中农业大学硕士学位论文鸡病毒性呼吸道病原多重RT-PCR检测方法的建立AMultiplexRT-PCRAssayforSeveralRespiratoryVirusesinChickenPathogens研究生：姚蓉指导教师：毕丁仁教授指导小组：毕丁仁教授石德时副教授王喜亮副教授李自力副教授刘梅副教授肖运才副教授栗绍文副教授孟宪荣讲师金卉讲师专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物与免疫学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2012年

4、6月华中农业大学动物医学院二O—二年六月目录摘耍IABSTRACTIll缩略语(ABBREVIATION)V1文献综述11」多重PCR技术简介11.1」PCR技术的概述11.1.2提高PCR反应特异性方法的概述11.1.3PCR技术的分类21.1.4多重PCR的原理41.2多重PCR在病原检测中的应用51.3禽呼吸道疾病病原概述61.3.1新城疫病毒61.3.2鸡传染性支气管炎病毒71.3.3禽流感病毒91.4禽呼吸道疾病病原混合感染的概述101.4.1禽呼吸道疾病病原混合感染的传统检测方法101.4.2禽呼吸道疾病病原混合感染的多重PCR检测101.4.3多重

5、RT-PCR检测禽呼吸道疾病病原混合感染的概述102研究目的与意义123材料与方法133」实验材料133.1.1禽呼吸道疾病病原病毒株133.1.2主要试剂133.1.3主要器材133」.4载体及菌株143.1.5试剂配制143.2实验方法153.2.1引物的设计以及合成153.2.2RT-PCR模板的制备163.2.3普通PCR体系的初步建立173.2.4多重PCR体系的条件优化193.2.5特异性试验203.2.6皱感性试验213.2.7临床诊断213实验结果224」普通PCR体系的初步建立224.1.1退化温度的优化224.1.2引物浓度优化224.1.3

6、PCR产物序列的测定234.1.4普通PCR优化结果234.2多重PCR体系的条件优化244.2.1Mg"浓度的优化244.2.2四种引物浓度比的优化254.2.3Tag酶浓度的优化264.2.4dNTP浓度的优化264.2.5退火温度的优化274.2.6多重PCR优化的结果284.3特异性试验284.4敬感性试验294.5临床诊断304讨论325」多重RT-PCR检测方法的优势325.2多重RT-PCR引物设计的讨论325.3多重RT-PCR条件优化的讨论335.4特异性试验和敬感性试验的讨论335.5多重RT-PCR技术的应用345.6本试验的不足Z处345

7、结论35参考文献35致谢41••鸡的呼吸道感染在养鸡生产实践中是一类极为常见的疾病。感染病原包括病毒、细菌、霉形体以及其它致病因索。大多数情况下是几种病原的混合感染或不同病原先后继发感染，致使雏鸡生长发育迟缓、成年鸡产蛋下降，可引起各种日龄鸡只的死亡。鸡新城疫(Newcastledisease,ND)^鸡传染性支气管炎(Infectiouslaryngotrache,IB)以及禽流感(Avianinfluenza,AI)的H5、H9亚型是一类在临床上冇相似呼吸道症状的病毒性传染病，均属T*RNA病毒，仅根据临床症状和病理表现很难准确及时作出诊断。不同的病毒感染其

8、后续的处置方案亦不相同，延误诊断时间或误诊均能给养鸡企业造成重人经济损失。因此，本实验拟建立ND-IB-AIH5-AIH94种禽类呼吸道病原的多重RT-PCR鉴别诊断方法，并对其特异性和敏感性进行检测，为临床上提供特异性强、頌感性高且省时省力的实验室鉴别诊断方法，其主要试验结果如下:1.4种禽类呼吸道病原扩增引物的设计和扩增方法的建立根据NDV的F基因片段，IBV的N基因片段以及AIV的H5、H9亚型的HA基因片段设计引物，对四对引物分别进行梯度RT-PCR扩壇，在此基础上选择合适的RT-PCR的退火温度同吋对四对引物分别进行引物浓度的优化，确定普通RT-PCR

9、的退火温度为58°C,?