卵转铁蛋白补铁产品的开发及其功效评价

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HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY硕士学位论文MASTER’SDEGREEDISSERTATION卵转铁蛋白补铁产品的开发及其功效评价DEVELOPMENTOFOVOTRANSFERRIN-IRONAGENTANDTHEEVALUATIONOFITSEFFICACY研究生:何恩祺CANDIDATE：HEENQI导师:马美湖教授SUPERVISOR：PROFESSORMAMEIHU闻胜副研究员ASSOCIATERESEARCHERWENSHENG学位类型:工程硕士DEGREETYPE：MASTERDEGREEOFENGINEERING领域:畜产食品工程FIELD：ANIMALFOODENGINEERING中国武汉WUHAN，CHINA二○一四年六月JUNE，2014万方数据 学校名称：华中农业大学单位代码：10504分类号：密级：华中农业大学硕士学位论文卵转铁蛋白补铁产品的开发及其功效评价DevelopmentofOvotransferrin-IronAgentandtheEvaluationofitsEfficacy研究生：何恩祺学号：2012309120033指导教师：马美湖教授学位类型：工程硕士领域：畜产食品工程华中农业大学食品科学技术学院中国.武汉CollegeofFoodScienceandTechnologyHuazhongAgricultralUniversityWuhan,China万方数据 万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价目录目录...............................................................................................................................i摘要.............................................................................................................................IAbstract.........................................................................................................................III缩略语表........................................................................................................................V第一章绪论...................................................................................................................11.我国居民铁缺乏及缺铁性贫血概况...................................................................12.铁的吸收代谢与调控..........................................................................................22.1铁的分布.....................................................................................................22.2铁的吸收.....................................................................................................22.2.1铁进入肠细胞....................................................................................22.2.2铁从肠细胞中输出至血浆................................................................32.3铁的运输（Tf-TfR1系统）........................................................................42.4铁代谢的调节.............................................................................................52.4.1IRP-IRE体系：细胞水平的铁代谢调节...........................................52.4.2铁调素（Ferritin）：系统水平的铁代谢调节..................................63.补铁剂的发展历程..............................................................................................73.1第一代补铁剂..............................................................................................83.2第二代补铁剂..............................................................................................83.3第三代铁剂..................................................................................................93.4血红素铁....................................................................................................113.5蛋白质螯合铁............................................................................................114.蛋白质螯合铁的优势及研究进展.....................................................................124.1蛋白质螯合铁的吸收代谢机理................................................................124.2具有补铁和补充蛋白质等多种生理功能，为多效补铁剂......................144.3无毒副作用，为健康补铁剂....................................................................155.本课题的研究意义与主要研究内容.................................................................165.1研究意义....................................................................................................165.2主要研究内容............................................................................................16第二章卵转铁蛋白的提取及相关指标的测定.........................................................18i万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.材料与方法.......................................................................................................181.1材料...........................................................................................................181.1.1原料.................................................................................................181.1.2试剂.................................................................................................181.1.3仪器与设备......................................................................................191.2方法...........................................................................................................201.2.1卵转铁蛋白提取工艺流程...............................................................201.2.2蛋重测定..........................................................................................201.2.3SDS-PAGE测定卵转铁蛋白的纯度................................................201.2.4火焰原子吸收法测定卵转铁蛋白粉中的铁含量............................211.2.5体外模拟消化实验..........................................................................223+1.2.6Holo-卵转铁蛋白在SGF中Fe的释放情况.................................222.结果与分析.......................................................................................................232.1SDS-PAGE测定卵转铁蛋白的纯度.........................................................232.2火焰原子吸收法测定卵转铁蛋白粉中的铁含量......................................242.3体外模拟胃消化实验................................................................................252.3.1体外模拟胃消化SDS-PAGE电泳情况...........................................253+2.3.2Holo-卵转铁蛋白在模拟胃液中释放Fe的情况...........................252.4卵转铁蛋白相关指标汇总及成品展示.....................................................273.小结与讨论.......................................................................................................28第三章卵转铁蛋白铁及其配方产品的补铁功效评价...............................................291.材料与方法.......................................................................................................291.1材料...........................................................................................................291.1.1原料.................................................................................................291.1.2动物与饲料......................................................................................291.1.3试剂.................................................................................................301.1.4仪器与设备......................................................................................301.2方法...........................................................................................................311.2.1实验动物..........................................................................................311.2.2动物饲料..........................................................................................311.2.3四组补铁剂的组成.........................................................................32ii万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价1.2.4中药选取依据...................................................................................321.2.5IDA模型的建立...............................................................................321.2.6补铁期实验方案...............................................................................331.2.7样本的采集和处理...........................................................................331.2.7.1全血的采集和处理................................................................331.2.7.2血清的制备和处理................................................................341.2.7.3脏器的采集和处理................................................................341.2.8指标的测定......................................................................................341.2.8.1全血指标的测定....................................................................341.2.8.2血清铁蛋白（SF）的测定....................................................341.2.8.3血清铁含量（SI）的测定.....................................................341.2.8.4肝脏指数、脾脏指数的测定.................................................341.2.8.5肝脏白度的测定....................................................................351.2.9数据处理和统计分析......................................................................351.2.10动物实验设计示意图....................................................................362.结果与分析........................................................................................................372.1IDA模型的建立........................................................................................372.1.1建模期大鼠的体重增长情况...........................................................372.1.2建模结束时正常组与IDA模型组全血指标情况............................372.1.3建模分组后各组生理指标情况........................................................382.2补铁期各组大鼠指标测定结果.................................................................382.2.1补铁期各组大鼠体重增长情况........................................................382.2.2补铁期大鼠RBC测定结果............................................................392.2.3补铁期大鼠Hb测定结果................................................................402.2.4补铁期大鼠HCT测定结果.............................................................412.2.5补铁期大鼠MCV测定结果............................................................422.2.6补铁期大鼠RDW测定结果............................................................432.2.7不同补铁时期大鼠全血指标直观比较图........................................452.2.8大鼠血清指标测定结果（21d）......................................................462.2.9大鼠肝脏指数和脾脏指数测定结果（21d）..................................472.2.10大鼠肝脏白度及色泽测定结果（21d）........................................48iii万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文2.2.10.1大鼠肝脏白度测定结果.......................................................482.2.10.2大鼠肝脏色泽比较..............................................................483.小结与讨论.......................................................................................................49第四章卵转铁蛋白补铁片剂的研制........................................................................511材料与方法........................................................................................................511.1材料..........................................................................................................511.1.1原料................................................................................................511.1.2试剂................................................................................................511.1.2仪器与设备.....................................................................................521.2片剂压制工艺流程...................................................................................521.3指标评价或测定方法...............................................................................521.3.1片剂外观评价标准.........................................................................521.3.2片剂崩解时限测定方法..................................................................521.3.3片剂硬度测定方法.........................................................................531.3.4粘冲率............................................................................................531.3.5正交试验片剂的综合评分..............................................................531.4单因素实验设计.......................................................................................531.4.1片剂压制预实验.............................................................................531.4.2微晶纤维素（MCC）粒度对片剂外观的影响..............................531.4.3硬脂酸镁添加量对片剂粘冲情况的影响.......................................531.4.4微晶纤维素添加量对片剂成型性及硬度的影响...........................541.4.5交联聚乙烯吡咯烷酮添加量对片剂崩解时限的影响...................542.结果与分析.......................................................................................................542.1片剂压制预实验结果...............................................................................542.2微晶纤维素粒度对片剂表面白斑情况的影响.........................................542.3硬脂酸镁添加量对片剂粘冲情况的影响................................................552.4微晶纤维素添加量对片剂成型及指标的影响.........................................552.5交联聚乙烯吡咯烷酮添加量对片剂崩解时限的影响.............................562.6正交实验设计及结果...............................................................................562.6.1正交实验设计.................................................................................562.6.2正交实验结果.................................................................................57iv万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价2.7验证性实验结果.......................................................................................582.8操作关键点控制.......................................................................................582.8.1原辅料的保存..................................................................................582.8.2物料混合.........................................................................................582.8.3片剂压制.........................................................................................582.9卵转铁蛋白铁片剂成品展示....................................................................593.小结与讨论........................................................................................................59第五章卵转铁蛋白铁片剂生产经济技术分析...........................................................611.卵转铁蛋白铁片剂工厂生产流程.....................................................................622.卵转铁蛋白铁片剂生产线主要设备及选型......................................................622.1生产线产能估算.......................................................................................622.2主要设备选型...........................................................................................623.卵转铁蛋白铁片剂生产经济技术分析.............................................................633.1项目总投资估算.......................................................................................633.1.1建筑工程费.....................................................................................633.1.2装修工程费.....................................................................................633.1.3设备购置费用..................................................................................633.1.4设备维护及管理费用......................................................................633.1.5技术服务费.....................................................................................643.1.6低值易耗品购置费..........................................................................643.1.7不可预见性开支..............................................................................643.1.8流动资金.........................................................................................643.1.9工程总投资汇总..............................................................................643.2项目成本费用估算....................................................................................653.2.1原辅料成本估算..............................................................................653.2.2水电费用估算..................................................................................653.3.3包装材料费用估算..........................................................................663.3.4员工工资及福利费用估算..............................................................663.3.5固定资产折旧费用估算...................................................................673.3.6项目管理费用估算..........................................................................673.3.7销售费用估算..................................................................................67v万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文3.3.8年成本费用汇总.............................................................................673.3投资回收效益分析...................................................................................683.4风险分析..................................................................................................693.4.1盈亏平衡点.....................................................................................693.4.2经营安全率.....................................................................................694.小结...................................................................................................................69第六章结论...............................................................................................................701.结论...................................................................................................................702.本研究的创新点...............................................................................................71参考文献......................................................................................................................72附录............................................................................................................................80致谢............................................................................................................................84vi万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价摘要本文以源自鸡蛋中的铁结合卵转铁蛋白为研究对象，研究了其在模拟胃液中的铁离子释放情况，测定了铁含量等相关指标；通过动物实验对铁结合卵转铁蛋白及其配方产品的补铁功效进行了评价，并对相应产品的生产工艺和辅料配方进行了研究；同时对该补铁产品项目的投资、成本、收益、风险等进行了分析。主要结论如下：采用乙醇一次提取法提取Holo-卵转铁蛋白原料，采用SDS-PAGE、AAS等方法对其进行鉴定，结果表明所提得的5批Holo-卵转铁蛋白中主要杂蛋白为卵类黏蛋白，Holo-卵转铁蛋白纯度约为54.9±0.4%，得率约为91.24±1.05%，铁含量约为0.965±0.034mg/g蛋白质；同时对提取所得Holo-卵转铁蛋白在SGF中的消化性能进行了评价，结果表明Holo-卵转铁蛋白在SGF中于5s内被分解成15kd以下的肽段，3+消化性能极好；随后，又采用磺基水杨酸法对卵转铁蛋白在SGF中的Fe释放情况3+进行了检测，结果表明Fe在2min的时间内基本释放完全。通过动物实验对卵转铁蛋白补铁剂的补铁功效进行了评价，测定了实验动物的RBC、Hb、HCT、MCV、RDW、SI、SF、肝脏指数、脾脏指数、肝脏白度等指标，并观察了其肝脏颜色。结果表明卵转铁蛋白铁剂对IDA模型大鼠具有显著的恢复作用，随着补充时间的延长，各项指标逐步改善；补铁前10d，全血各项指标改善幅度较大，之后放缓，在补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组和复合配方2组均能够使IDA大鼠的全血、血清、脏器的各项指标得到极显著的恢复。单独补充OTf-Fe的补铁效果略优于FeSO4组，复合配方1组的补铁效果则非常显著地优于FeSO4组，复合配方2组的补铁效果逊于复合配方1组，但优于FeSO4组。与正常对照组相比，单独补充OTf-Fe组和复合配方2组仍有多项指标与之有显著（P<0.05）或极显著差异（P<0.01），而复合配方1组的除RDW之外的所有指标均达到或接近正常水平。在动物实验的基础上，选择复合配方1组作为主料配方，以粉末直接压片法制备卵转铁蛋白铁片剂产品，对片剂的辅料添加量进行了研究；通过单因素实验、正交实验和验证性实验，确定了卵转铁蛋白铁片剂的最佳辅料配方为：微晶纤维素20%，硬脂酸镁0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮5%；综合复合配方1组的主料配方，得到卵转铁蛋白铁补铁产品的最终配方为：卵转铁蛋白铁0.5g、富马酸亚铁1.63mg、I万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文抗坏血酸12.58mg、阿胶0.1g、大枣与枸杞子水提物0.1g（生药比5:4）、微晶纤维素0.1g、硬脂酸镁3.5mg、交联聚乙烯吡咯烷酮25mg。最后对卵转铁蛋白铁片剂生产项目进行了经济技术分析，对该项目投资、生产成本、利润进行了估算，分析了其投资回收效益和风险。结果表明卵转铁蛋白铁片剂生产项目可实现年销售收入约10647万元、年毛利润约6936.641万元、净利润约3905.329万元，每年可实现利税约3031.312万元，投资回收期为半年左右，盈亏平衡点销售额为374.1万元，经营安全率达96.49%。本文以产品开发为导向，通过对上述内容的研究，开发出了一种以卵转铁蛋白为载体的，多功能、低毒副作用的新型补铁剂，填补了市场空白，推动了对新型蛋白质螯合铁补铁剂的探索和应用。关键词：鸡蛋；卵转铁蛋白；蛋白铁；缺铁性贫血II万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价Abstract3+Inthispaper,eggsderivedironbindingovotransferrinhasbeenstudied.Fereleasesituationinsimulatedgastricfluid,theironcontentandotherrelatedindicatorsofholo-ovotransferrinhasbeendetermined.Theironsupplementaryefficayofironbindingovotransferrinanditsformulashasbeenevaluatedthroughanimalexperiments.Theauxiliarymaterialsrecipeandtheprocessflowofthecorrespondingproducthavebeenresearched.Additionally,thecosts,benefitsandrisksoftheironsupplementaryproductitemwereanalyzed.Themainconclusionsareasfollows.Asrawmaterial,holo-ovotransferrinwasextractedusingethanol.Characteristicsoftheholo-ovotransferrinwasconductedusingSDS-PAGE,AASandothermethods.Theresultsshowthatthemajormiscellaneousproteinoftheobtainedholo-ovotransferrinisOTfmucoid,thepurityisabout54.9±0.4%,theyieldisabout91.24±1.05%,theironcontentisabout0.965±0.034mg/gprotein.Inthemeantime,thedigestibilityoftheobtainedholo-ovotransferrininSGFwasevaluatedandtheresultshowsthatholo-ovotransferrinwasdegradedintopeptideswhosemolecularweightwasbelow15kda.Subsequently,thereleasesituationofholo-ovotransferrinintheSGFwastested3+usingthesulfosalicylicacidmethodandtheresultindicatethattheFewascompletelyreleasedduringtwominutes.Theironsupplementaryefficacyoftheovotransferrin-ironagentswasevaluatedthroughanimalexperiment.RBC,Hb,HCT,MCV,RDW,SI,SF,liverindex,spleenindexandliverwhitenessindexoftheexperimentalanimalsweredeterminedandtheirlivercolorwasobserved.Theresultsshowedthatovotransferrin-ironagentscansignificantlyimprovetheindicatorsoftheIDArats.Withtheadministrationtimeprolonged,alltheindicatorsgraduallyimproved.WholebloodindicatorsoftheIDAratsweregreatlyimprovedduringthebeginning10daysandthenbecameslow.After21daysofadministration,thewholebloodindicators,serumindicatorsandvisceraindicatorsoftheIDAratsingroupofOTf-Fe,formula1andformula2weregreatlyrecovered.TheefficacyofOTf-FewasslightlybetterthanthatofFeSO4.Whiletheefficacyofformula1wassignificantlybetterthanFeSO4.Theefficacyofformula2wasinferiorthanformula1,butbetterthanFeSO4.ManyindicatorsofgroupofOTf-feandformula2stillhadsignificantdifferencewithnormalcontrolgroup.Whilealltheindicatorsofformula1groupexceptforRDWreachedorwasclosetothenormalcontrolgroup.III万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文Onthebasisofanimalexperiment,ovotransferrin-irontabletswasproductedbydirectpowdercompressionandformula1wasselectedasmainingredients.Singlefactorexperiment,orthogonalexperimentandreplicationexperimentwereconductedinordertodetermintherecipeofauxiliarymaterialsofovotransferrin-irontablet.Theresultsindicatethattheoptimalformulaofauxiliarymaterialsofovotransferrin-irontabletwas:microcrystallinecellulose20%,hardmagnesiumstearate0.7%,crospolyvinylpyrrolidone5%.Auxiliarymaterialsrecipeintegratedwithformula1,thenthefinalformulaofovotransferrin-irontabletwaspresented:holo-ovotransferrin0.5g,ferrousfumarate1.63mg,ascorbicacid12.58mg,collacoriiasini0.1g,jujubeandmedlaraqueousextract0.1g(crudedrugratio5:4),microcrystallinecellulose0.1g,magnesiumstearate3.5mg,crospovidone25mg.Eventually,economicandtechnicalanalysiswascarriedoutfortheovotransferrin-irontabletproject.Investments,productioncosts,profitswereestimatedandthepaybackperiodandriskswereanalyzed.Theresultsshowedthatthisprojectcouldachieveannualsalesrevenueofabout106.47millionRMB,annualgrossprofitofabout69,366,410RMB,netprofitofabout39,053,290RMB,annualtaxescanberealizedapproximatelyof30,313,120RMB.Andthepaybackperiodwasabout6months,thesaleamountatthebreakevenpointwas3,741,000RMB,operatingsaftyratiowas96.49%.Theresearchwasproduct-orientedinwhichanewtypeofironsuplementaryagentwhichhadmultiplefunctiosandlessside-effectswasdevelopedusingovotransferrinascarrier.Theovotransferrinironsuplementaryagentfillsthegapsinthemarketandpromotetheexplorationandapplicationoftheprotein-ironchelates.Keywords:egg;ovotransferrin;ironproteinate;irondeficiencyanemiaIV万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价缩略语表缩略词英文全称中文名全称OTfOvotransferrin卵转铁蛋白Holo-OTfHolo-Ovotransferrin铁饱和卵转铁蛋白OTf-FeOvotransferrin-Fe铁结合卵转铁蛋白SGFSimulatedGastricFluid模拟胃液RBCRedBloodCell红细胞计数HbHaemoglobin血红蛋白浓度HCTHematocrit红细胞压积MCVMeanCorpuscularVolume平均红细胞体积RDWRedCellDistributionWidth红细胞体积分布宽度SISerumIron血清铁含量SFSerumFerritin血清铁蛋白MCCMicrocrystallineCellulose微晶纤维素PVPPPolyvinylpyrrolidoneCross-linked交联聚乙烯吡咯烷酮flFlyLiter飞升V万方数据 万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价第一章绪论1.我国居民铁缺乏及缺铁性贫血概况铁是人体所必须的微量元素，它参与血红蛋白的合成，是机体运输和供应氧气的保障；铁还是实现许多大脑功能所必须的，比如神经纤维髓鞘的形成，大脑能量的代谢等；此外铁还是参与神经递质合成的多种酶的辅因子（R.RaoandM.K.Georgieff,2001;J.L.Beard,2001）；DNA的复制和修复也需要与铁有关的酶的参加。铁缺乏将严重影响婴儿、学龄前儿童和学龄儿童的认知、行为能力和身体发育；降低全年龄段人口的免疫力和抗感染能力；影响肌肉对能量的利用，从而导致工作效率降低；此外，铁缺乏还会导致机体胃肠道功能受损、荷尔蒙分泌和代谢紊乱，后者会导致机体的抗寒能力下降（WorldHealthOrganization,2001）。有报道称，铁缺乏影响着世界上10亿以上人口的身体健康（F.TrowbridgeandR.Martorell,2002），其危害不言而喻。世界卫生组织（WHO）将机体内没有可供利用的储存铁（铁蛋白或含铁血黄素），并且有明显的信号表明机体内组织存在妥协供铁（compromisedsupplyofiron）的状态定义为铁缺乏（irondeficiency）。铁缺乏依照严重程度可分为两个阶段：铁缺乏未贫血和铁缺乏贫血。后者就是我们常说的缺铁性贫血（Irondeficiencyanaemia，IDA）（WorldHealthOrganization,2001）。IDA是世界上发病率最高的营养素缺乏疾病之一。根据世界卫生组织的报告，世界范围内有24.8%的人口患有贫血，其中以发展中国家尤为严重；贫血患者一般为儿童、青少年以及女性，全球范围内学龄前儿童贫血患病率为47.4%，孕妇贫血患病率为41.8%，未怀孕妇女患病率为30.2%。而通常认为50%以上的贫血是由于铁元素缺乏所引起的（该数据因地域不同而存在较大差异）（WorldHealthOrganization,2008），这意味着全球有超过8.5亿的人口患有缺铁性贫血。可以说IDA是铁缺乏引起的最为严重、对人们生活影响最大的疾病。世界卫生组织和世界银行报道称IDA是导致育龄妇女伤残调整生命年（DALY）损失的第三大影响因素，并排在15-44岁男性疾病负担的前十位（R.Yip,2002）；在发展中国家中，儿童和妇女都极大地受到IDA的影响（F.TrowbridgeandR.Martorell,2002）。随着我国经济社会的迅速发展，国民生活水平的不断提高，我国人口的铁缺乏情况和贫血情况相比其它发展中国家要好很多，但却仍不容乐观，尤其是在儿童、妇女这样一些特殊群体中；根据WHO提供的数据，中国的学龄前儿童、孕妇和未1万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文怀孕育龄妇女的贫血患病率分别为20%、28.9%和19.9%（WorldHealthOrganization,2008），而这其中IDA占据着绝大部分比重。总的来说，铁缺乏及IDA在我国及世界范围内普遍存在，而解决这一世界性难题的一个最重要的措施是通过补铁剂对铁缺乏人群进行营养补充。2.铁的吸收代谢与调控铁在人体内是如何被吸收的，又是如何被调控的？这对于一个补铁剂的开发者来说是必须要了解的背景知识（已经被研究的比较清楚），因此最后这一节便介绍铁的吸收代谢与调控方面的研究情况。2.1铁的分布人体包含有大约3-5g的铁，其中大部分（60%-70%）被用于合成血红蛋白(红细胞及骨髓中的)(Andrews,1999;Ponka,1997)，其次是分布在肝脏（主要贮存于铁蛋白和含铁血黄素中）和网状内皮组织巨噬细胞中（共20%-30%）,其它的铁则主要集中于肌红蛋白、细胞色素和含铁酶系中。健康个体每天只需从膳食中获取1-2mg的铁，用以弥补肠道、皮肤表皮细胞脱落所损失的铁。此外，女性在月经期会由于失血而引起铁损失。人体内的铁绝大部分是可以被循环利用的，这主要是通过巨噬细胞吞噬老化的红细胞，释放其中的铁元素而获得，也有一小部分是来自肌红蛋白和各种氧化还原酶。另外，人体血浆中的转铁蛋白（transferrin）结合铁始终保持大约3mg，并处于动态平衡之中（G.Papanikolaou和K.Pantopoulos,2005）。2.2铁的吸收2.2.1铁进入肠细胞铁吸收的主要部位是十二指肠和空肠上段。食物中的铁主要以两种形式存在——血红素铁和非血红素铁（一般是三价铁）。有证据表明血红素铁可能是通过某种特殊的运载体进入肠细胞，但这种运载体到底是什么还不甚清楚(Shayeghi,M等，2005；Qiu,A等，2006)。胃分泌的酸性物质能够溶解铁，并促进Fe（III）的还原。大量资料表明肠细胞顶端表面存在一类铁还原酶，能够将Fe（III）转化成Fe(II)。目前认为Dcytb是其中之一，它能够将胞液辅酶II中的电子跨膜传递给Fe（III）。2万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价但有定向切除Dcytb基因的小鼠并未出现显著的铁相关的显型，这说明Dcytb可能并不是肠细胞表面唯一的铁还原酶（Gunshin,H等，2005）。肠细胞顶端粘膜上存在一种二价金属离子转运体——DMT1（有的文献中也称为DCT1或Nramp2）。它是肠道内唯一的铁摄取者，是天然抵抗相关性巨噬细胞蛋白（Nramp）家族中的一员。DMT1定向删除的小鼠不能从肠道内吸收铁，从而患有严重的贫血（Gunshin,H等，2005）。DMT1在小肠顶端细胞表面以及所有细胞的核内体表面都有表达。其转运是通过质子耦合机制完成的。DMT1除了能够转运Fe(II)之外，还可以转运其它的二价金属离子，比如Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+。由于DMT1只能够转运二价金属离子，这从侧面也说明的小肠顶端细胞表面确实需要有铁还原酶。2.2.2铁从肠细胞中输出至血浆铁经DMT1的转运进入肠细胞后，要么储存于胞液中的铁蛋白（Ferritin）中，要么通过肠细胞基底外侧膜输出至血浆中。但是铁要输出必须依赖于人体内唯一的铁输出蛋白——Ferroportin。这种蛋白质在所有与铁输出相关的细胞中都有表达，主要是十二指肠粘膜细胞、巨噬细胞，以及胎盘细胞。研究表明胎盘中的Ferroportin是母体将铁传递给胎儿所必须的(Donovan,A等，2000；Donovan,A等，2005)。同时它也是巨噬细胞进行铁循环所必须的。Ferroportin转运的铁被认为是Fe(II)，因为它与一族能将Fe(II)转变成Fe(III)铁氧化酶关系密切，协同作用。这是一种多铜氧化酶，包括hephaestin和铜蓝蛋白，它们以氧作为电子受体，将Fe(II)转变成Fe(III)（Roeser,H.P.等，1970）。Hephaestin在肠细胞基底外侧膜上有表达，在视网膜上皮层也有表达。小鼠Hephaestin是被X染色体上的一个基因所编码的，对这个基因进行突变，结果导致伴性的铁限制性贫血，这是由于肠粘膜铁输出障碍引起的（Vulpe,C.D.等，1999）。铜蓝蛋白则主要在巨噬细胞和大脑中表达（GPI（糖磷酯酰肌醇）-linked铜蓝蛋白）。同样地，铜蓝蛋白合成障碍也会导致铁输出障碍，并引起实质组织的铁过载。并且但是在不能合成铜蓝蛋白的培养细胞内，若添加具有使Fe(II)转变成Fe(III)功能的试剂，铁输出又能够得以恢复（DeDomenico,I.等，2007）。3万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文这些数据表明Hephaestin和铜蓝蛋白使Fe(II)转变为Fe(III)，从而产生了一种化学梯度，这种化学梯度ferroportin介导的铁输出的驱动力。也就是说，没有铁氧化酶，Fe(II)不能通过ferroportin输出，并在细胞内的铁蛋白中积累。2.3铁的运输（Tf-TfR1系统）铁被ferroportin从肠细胞输出至血浆中之后便与Tf结合。Tf是一种80kDa的糖蛋白，具有同源的N-端和C-端，两端分别有一个铁结合域，在肝脏、视网膜、睾丸和大脑中合成。在血液的中性pH条件下，Tf能够结合2个三价铁原子，其解离常数（Kd）为10-23M。Fe(III)与Tf的结合只有在阴离子存在的条件下才能进行，通常是碳酸盐，这个阴离子起到桥接铁离子与Tf的作用。血浆中的Tf-Fe(III)复合物与细胞表面的2种转铁蛋白受体（TfR）之一的TfR1结合，而后进入细胞。TfR1是两个完全相同的跨膜转运亚基通过二硫键构成的同源二聚体。每个亚基都由一大部分的位于细胞外的C-端区域，一个疏水的跨膜区域，以及一小部分细胞质内的N-端区域。每个亚基的细胞外部分结合一分子Tf，形成Tf-TfR1复合物（Cheng,Y.等，2004）。TfR1在所有分化的细胞中都有表达，但是在红细胞前体细胞（网织红细胞）中特别丰富，因为这些细胞对铁的需求量最大（Aisen,P.，2004）。而TfR2则主要在肝脏表达，其结合Tf-Fe（III）的亲和力较TfR1低很多。在与受体结合之后，Fe(III)-Tf-TfR1复合物很快被受体介导的细胞内吞作用通过―网格蛋白包被小窝‖而内化。在细胞内，内化的复合物集中于核内体中，核内体被一个―ATP-依赖‖的质子泵酸化至pH5.5。酸化引起Tf-Fe(III)和TfR1的构象变化，随后铁便被释放（Sipe,D.M.和Murphy,R.F.，1991；Bali,P.K.等，1991）。核内体中的Fe(III)在被称为STEAP3的铁还原酶作用下被转化为Fe(II)。核内体表面的DMT1将STEAP3催化反应的产物从核内体运输至胞液中，以供细胞利用（比如合成血红蛋白）。apoTf（缺铁转铁蛋白）与TfR1在酸性pH条件下仍结合在一起，而后apoTf-TfR1复合物到达细胞内表面，进而外化至细胞外，在中性的血浆环境下，Tf与TfR1解离，各自进行新一轮的循环。此外，一些研究也表明可能存在不依赖于Tf的铁运输体系，这种体系在没有Tf或者Tf饱和的情况下发挥作用。4万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价2.4铁代谢的调节2.4.1IRP-IRE体系：细胞水平的铁代谢调节IRE全称是铁反应元件（IronReactiveElement），是存在于铁代谢相关蛋白mRNA的非翻译区（UntranslatedRegion,UTR）的一种―主干-环‖结构的物质，由30个核苷酸构成。而IRP是铁调节蛋白（IronRegulatoryProtein），有两种不同类型——IRP1和IRP2。它们具有重要的同源性，并同属于Fe-S簇异构酶蛋白质家族，这个家族也包括线粒体顺乌头酸酶。但是，只有IRP1能够形成顺乌头酸酶形式的4Fe-4S簇结构，这决定了它调节铁代谢的模式和作用位点。IRP1在乌头酸酶（具有4Fe-4S簇，有酶活性）形式和IRE结合活性形式（没有4Fe-4S簇，无酶活性，有IRE结合活性）之间存在一种受细胞铁调节的平衡：铁含量增加时，促进IRP1由IRE结合活性形式向乌头酸酶形式转变，从而降低IRP1的IRE结合活性；铁含量降低时，平衡则向相反方向移动。IRP1对其它刺激也有响应，比如NO或过氧化氢，它们也可以激活IRP1的IRE结合活性，尽管是通过其它途径(Pantopoulos等，1996)。其中过氧化氢激活IRP1的活性需要引起我们的特别重视，因为这种ROI（ReactiveOxygenIntermediate）与铁的毒性密切相关。IRP2在转录后水平以不同的机制受到铁和氧供给的调控(Hentze等，2004；Pantopoulos,2004)。它在―铁饥饿‖细胞中从头进行合成，并在这种条件下或缺氧条件下保持稳定。相比之下，IRP2在―铁充足‖含氧量正常的细胞中或在暴露于亚硝基铁氰化钠（一种用于蛋白质巯基亚硝基化的含铁化合物）的细胞中，会被蛋白酶体降解。IRP-IRE体系能够在转录后水平对与铁代谢相关的多种蛋白质进行调控，尤其是对TfR1和Ferritin的调节已经研究得比较清楚。这种调控基于对铁含量水平的应答，并包含mRNA-蛋白质相互作用(Hentzeetal.,2004;Pantopoulos,2004)。当细胞处于―铁饥饿‖状态时，IRP1和IRP2被激活，它们便与mRNA非翻译区（UTR）上的IREs进行结合，进而对铁代谢进行调控。IRPs与IREs在mRNA的5’非翻译区结合则阻断其翻译过程，而若在mRNA的3’端非翻译区结合则能够使mRNA更加稳定，并防止其分解。这样便能促进―铁饥饿‖细胞通过Tf-TfR（其mRNA3’端UTR上含有5个IRE）途径摄取铁，同时抑制Ferritin（其mRNA5’端UTR上有1个IRE）的5万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文合成。当细胞处于―铁充足‖状态时，IRP1和IRP2均失去IRE结合活性（以不同机制），从而抑制细胞进一步从Tf中摄取铁，并促进细胞内过剩铁的贮存。除了TfR1和FerritinmRNA中含有IRE，其它一些与铁代谢相关的蛋白质的mRNA也含有IRE，比如DMT1和ferroportin都在其mRNA的5’端UTR含有IRE。并有研究表明这种5’端IRE具有重要功能。2.4.2铁调素（Ferritin）：系统水平的铁代谢调节铁调素是一种可以循环利用的肽激素，是防卫素（defensin）家族中的一员，主要由肝脏分泌，并在不同物种内被高度保留了下来（这与其它防卫素是不同的）。具有生物活性的铁调素是25-aa形式的，其中有8个Cys，这种形式具有一个84-aa形式的前体物（Nemeth,E.等，2006）。小鼠具有两个铁调素基因，但是只有其中的Hamp是有生物活性的。靶向切除小鼠中的Hamp基因，将导致最严重的铁过载疾病(Nicolas,G.等，2001)。相反，铁调素表达增加则导致铁吸收降低和缺铁性贫血（Nicolas,G.等，2002）。由此可见，铁调素调节铁运输进入血浆是一种负调节，其调节机理与ferroportin有关：Ferritin与ferroportin结合，然后依次使ferroportin磷酸化、内化、泛素化，再经过多泡小体的整理，最终ferroportin在溶酶体中被降解（DeDomenico,I.等，2007；Nemeth,E.等，2004）。Ferroportin的移除使细胞内的铁不能被输出而储存于铁蛋白中，若程度严重则会导致实质组织的铁过载。铁调素自身的合成主要受到炎症、组织缺氧和红细胞生成缺陷的调控，这种调控是在转录水平下进行的（Nicolas,G.等，2002）。在正常情况下，铁调素的表达依赖于通过BMPs（骨生成蛋白）和SMAD4（一种信号传导蛋白）传导的信号。特殊的BMPs与肝细胞表面的BMP受体结合，导致胞液中的SMADs受体（R-SMADs）的磷酸化。这些磷酸化的R-SMADs与SMAD4组成复合物，然后该复合物激活HAMP基因的转录。在这个过程中SMAD4是不可或缺的。炎症通过产生IL-6（白细胞介素-6）及某些其它的细胞因子，以诱导肝细胞中HAMP的转录（Nemeth,E.等，2004）。在肝细胞膜表面存在IL-6受体（IL6R），IL-6与结合之后产生某种信号，该信号传递给STAT-3（信号转化和转录激活器），STAT-3与HAMP启动子结合，进而转录被激活。在此调节过程中，SMAD4依然是必不可6万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价少的，若没有SMAD4，HAMP的转录将不能进行。炎症对铁调素表达的调节是一种正向调节。组织缺氧（hypoxia）也能对HAMP的转录进行调节。在低氧条件下，HAMP转录受到抑制，铁调素表达降低，进而导致输出至血浆中的铁含量上升（Nicolas,G.等，2002）。在脊椎动物中，低氧主要是被转录因子中的低氧诱导因子（HIF）家族所感知。在正常情况下，HIF被一种含铁的脯氨酰羟基化酶（Kaelin,W.G.Jr，2005）羟基化，而后则被一种泛素连接酶——von-Hippel-Lindau（VHL）因子所识别，VHL识别HIF之后便将其降解。在组织缺氧或缺铁的情况下，HIF很稳定，并作为转录因子抑制HAMP的转录。小鼠和人体中的HAMP基因启动子具有HIF结合位点，并且HIF1α能够结合在启动子上，这表明HIF家族的成员能够负向调节铁调素的表达。红细胞信号是负向调节铁调素表达的主要因素。红细胞生成缺陷将在不考虑肝脏中贮存铁状况的情况下，促使肠细胞中铁输出的增加。故患有红细胞生成缺陷的病人可能会同时患有贫血和实质组织铁过载。与红细胞信号相关的铁调节物质可能是一种细胞激素，叫做生长分化因子（growthdifferentiationfactor,GDF15），它由红细胞前体所分泌的（Tanno,T.等，2007），是转化生长因子超家族中的一员。红细胞生成缺陷导致红细胞前体增加，进而引起GDF15表达的增加。而在肝细胞表面有GDF15受体的表达，GDF15与其受体结合之后能够抑制HAMP的转录。3.补铁剂的发展历程补铁剂的开发始于17世纪的一个英国人，他把铁锈混在葡萄酒里用来治疗倦怠。1831年，法国Blaud教授成功运用硫酸亚铁和碳酸混合制成的片剂治疗了萎黄病。补铁剂的发展可以大致分为三个阶段：以硫酸亚铁、焦磷酸铁等无机铁为代表的第一代补铁剂；以乳酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁等有机酸铁为代表的第二代补铁剂；以及以FeNaEDTA、甘氨酸螯合铁、多糖铁复合物等为代表的第三代补铁剂。从另外一个角度来进行分类，补铁剂可以被分为血红素铁和非血红素铁。血红素铁在我国取得重要进展的时期与第二代补铁剂出现的时期大致相同。此外，近年来对乳铁蛋白铁、卵转铁蛋白铁等新型蛋白质螯合铁的相关研究也为开发新型、高效的补铁剂提供了一种新的可能。7万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文3.1第一代补铁剂第一代补铁剂的代表主要有硫酸亚铁、焦磷酸铁、焦磷酸亚铁、焦磷酸铁钠等，其中以硫酸亚铁应用最为广泛。硫酸亚铁呈蓝绿色结晶状或颗粒状，价格便宜，曾今是医院用于治疗IDA的首选铁剂，但其补铁效果一般，而且有明显的胃肠道刺激作用，能坚持服用者很少（尤其是孕妇），并且Fe2+在体内易产生内源性自由基，导致细胞膜脂质过氧化，造成细胞膜损伤(展筱林等，2008)，因此现在大部分医院不再使用硫酸亚铁作为治疗IDA的铁剂，而改为使用琥珀酸亚铁等更易为病人所接受的铁剂。将维生素C与硫酸亚铁并用，能有效提高铁的吸收率。英国首先将以维生素C为稳定剂的硫酸亚铁合剂收入药典。目前市面上以硫酸亚铁为铁源的代表产品主要有美赞臣婴儿纯铁补铁滴剂、NatureMadeIron、UltraIron65等。焦磷酸铁作为第一代铁剂的另一代表，常被作为食品添加剂添加到面粉、饼干、面包等食品中，制成铁强化食品。焦磷酸铁颜色浅，铁腥味较轻，对胃肠道刺激较小，于1994年被FDA列为GRAS（一般公认安全的）物质名单；但其补铁效果欠佳，DavidssonL.等（2000）采用同位素标记的方法对焦磷酸铁的生物利用度进行了研究，结果表明其生物利用度几何均数仅为1.3%，而与之对照的延胡索酸亚铁则达到了4.1%。3.2第二代补铁剂第二代补铁剂是一些小分子有机酸的亚铁盐，其中以乳酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、琥珀酸亚铁的应用最为广泛。乳酸亚铁是一种水溶性铁剂，含铁量大致为19%，平均相对生物利用度（相对于硫酸亚铁）为106，成本适中（ShrutiPandeyandVasudevaSingh,2013）。李晓明等(2002)对乳酸亚铁治疗缺铁性贫血的临床疗效进行了评价，证明其治疗效果与琥珀酸亚铁（公认的，有确切疗效的补铁剂）对照组的疗效无显著性差异。不过乳酸亚铁相关产品质量不稳定，颜色和铁腥味都很重，钙盐和硫酸盐残留多。我国市面上以乳酸亚铁为铁源的产品主要有体恒健牌铁之缘片、泰尔血素铁质维C叶酸片等。富马酸亚铁是一种弱水溶性铁剂，易溶于稀酸，成本低廉，含铁量高，铁味很轻，生物利用度与硫酸亚铁相当，是使用最广泛的补铁剂之一。LenaDavidsson等（2009）通过人体试验，对富马酸亚铁与维生素C配合补铁的效果进行了评价，发8万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价现其补铁效果与硫酸亚铁与Vc配合的补铁效果无显著性差异。Hurrell,R.（1999）则认为富马酸亚铁无疑是一种生物可利用的补铁剂。富马酸亚铁首先在胃中溶于胃酸，然后进入体内的非血红素铁池。我国市面上以富马酸亚铁为铁源的产品很多，其中代表产品有：海王血红素铁软胶囊、汤臣倍健叶酸亚铁片、安利纽崔莱铁质叶酸片、纽斯葆天然维生素e铁软胶囊等。葡萄糖酸亚铁是一种水溶性铁剂，有焦糖气味，成本适中，含铁量大致为12%，生物利用度较硫酸亚铁稍差（ShrutiPandeyandVasudevaSingh,2013）。Shamah-Levy,T.（2008）等对葡萄糖酸亚铁配方的婴儿食品与硫酸亚铁配方的婴儿食品的补铁效果进行了研究，发现葡萄糖酸亚铁配方的补铁效果是完全可以接受的。Casparis,D.和DelCarlo,P.（1996）等研究了4种补铁剂对孕妇或产后初期妇女的补铁效果，结果显示葡萄糖酸亚铁（固体或液体）与硫酸亚铁、蛋白质琥珀酸铁（三价）的补铁效果无显著差异，并且在感官上的可接受性最好。琥珀酸亚铁是一种弱水溶性铁剂，易溶于稀酸，含铁量约为35%，相对生物利用度为92，成本适中（ShrutiPandeyandVasudevaSingh,2013）。北京医科大学的窦焕福等（1991）对琥珀酸亚铁治疗IDA的疗效进行了评价，结果表明其治疗总有效率明显高于作为对照的硫酸亚铁组。目前，琥珀酸亚铁在我国主要作为临床药物，用于IDA的治疗，并已在很大程度上取代了硫酸亚铁，这主要是由于琥珀酸亚铁所引起的副作用较小、可耐受性相对较好。以琥珀酸亚铁为铁源的产品有永宁牌琥珀酸亚铁片（速力菲）等。3.3第三代铁剂第三代铁剂主要是一些新型的铁螯合物（复合物），中最具代表性的是FeNaEDTA、甘氨酸螯合铁、右旋糖酐铁以及多糖铁。FeNaEDTA具有生物利用率高（为硫酸亚铁的2-3倍），铁味轻，对肠胃刺激小，不影响产品感官性质等优点，特别适合用于各种谷物类制品的铁强化。由于其具有的这些优点，我国将FeNaEDTA用作营养素强化面粉的主要铁源，同时用于强化酱油，用在酱油中的添加量为175-210mg/100ml。此外FeNaEDTA还被大量用于乳及乳制品、固体饮料、饼干等食品的铁强化中。但是FeNaEDTA成本太高，这在一定程度上限制了它的应用。此外EDTA的螯合能力非常强，以其为载体开发成供人体食用的补铁产品具有诸多不确定因素，对人体可能存在某些副作用。9万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文铁与甘氨酸螯合后可以以氨基酸的形式直接被小肠吸收，故生物利用率较高。江南大学张晓鸣等(2008)通过大鼠实验对甘氨酸螯合铁与硫酸亚铁的补铁效果进行了评价和比较。结果表明对于健康大鼠，甘氨酸螯合铁的吸收利用效果明显好于硫酸亚铁；对于缺铁大鼠，甘氨酸螯合铁补铁比硫酸亚铁见效快。双甘氨酸亚铁已经被GRAS认定为天然复合物，不会有潜在抗生理反应，但容易促进谷类食品中脂肪氧化，出现颜色反应；同时甘氨酸螯合铁的成本很高，这在很大程度上限制了它的应用，市场上也未见有相关产品。右旋糖酐铁是一种葡聚糖铁，分子量大约为165kDa，它与琥珀酸亚铁一样主要被应用于临床，可以静脉注射的方式给药，多用于治疗慢性肾病、透析等引起的贫血，李璐等（2010，）将其用于治疗IDA，同样取得了理想的效果。由于右旋糖酐铁多采用静脉注射的方式，因此具有起效快、不良反应小等优点，尤其适用于患胃肠道疾病或不耐口服药物的患者。3+3+多糖铁以Fe为核心，多糖在铁核表面形成特定结构的化合物，并与Fe配合，3+进而形成稳定的Fe-多糖复合物。多糖铁复合物一般为棕色粉末，不溶于有机溶剂，3+易溶于水，水溶液呈中性，且无游离的Fe，在碱性条件下不水解（王宝琴等，2007）。EmmaM.Coe等（1995）通过高精度的X射线粉末衍射和EXAFS对多糖铁的代表产品―Niferex（力蜚能）‖的铁核结构和外围多糖结构进行了研究，发现这种多糖铁复合物的铁核具有与正方针铁矿相似的β-FeOOH长程有序（long-range-order）结构，大小约为5nm，这种结构也存在于其它类似的多糖铁复合物中，尤其是那些通过3+FeCl3的水解作用合成的多糖铁复合物；而与Fe进行配位的多糖则具有与铁蛋白相似的短程有序（short-rangeorder）的八面体结构。一项以早产婴儿为对象的研究表明多糖铁复合物与硫酸亚铁的补铁效果相当，而副作用较硫酸亚铁略少（NaudeS.et.al,2000）。AAPCC统计了810位服用多糖铁复合物患者的不良反应，结果显示共61位患者出现了呕吐等不良反应，表明其副作用较小，较其它补铁剂毒性更低（KleinSW.,2000）。近年来我国对多糖铁复合物的研究非常活跃，多以当归、大枣、银耳等中药为原料提取多糖，再与FeCl3进行反应制得多糖铁复合物。比如王花等（2006）以大枣为原料提取大枣多糖，然后采用化学合成的方法使之与FeCl3反应制得大枣多糖铁复合物，并对得到的复合物进行了性质和结构分析，表明大枣多糖与铁的结合位10万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价置为羟基，该复合物为β-FeOOH八面体结构，且稳定性良好、不溶于水、水溶液中3+无游离Fe。王佩佩等（2007）对当归多糖的补铁效果进行了评价，结果表明当归多糖铁复合物不仅具有与力蜚能相当的补铁效果，而且还具有补血和促进血液循环的功效。3.4血红素铁血红素铁是一种生物态铁，可以直接被肠粘膜细胞吸收，不会产生任何消化道刺激，生物利用率高（可达15%—25%），是硫酸亚铁等传统补铁剂的3倍。其制备方法有酶法和等电点法，其中酶法提取得到的产品性质更稳定且吸收利用率高。关于血红素铁的补铁效果我国已有多位学者先后进行了大量研究，例如钟才云等先后于1989、1995年对血红素铁进行了动物试验研究（大鼠）和人体试验研究（贫血女大学生），证明了血红素铁的高生物利用率（刘娅，2005）。王茵等（2007）对血红素铁和乳酸亚铁改善营养性贫血的效果进行了比较，结果发现以每毫克铁增加血红蛋白含量计算，血红素铁的补铁效果显著优于乳酸亚铁。3.5蛋白质螯合铁由于历代补铁剂均具有这样那样的缺陷，如铁腥味重、刺激胃肠道、效果不佳等，一些研究者开始将目光投向自然界中天然存在的蛋白质螯合铁，期望以某些自然界中天然存在的蛋白为铁的载体，开发出高效、耐受性好、更易为消费者所接受、适合人们长期使用的新型补铁剂。于是，转铁蛋白家族自然而然地进入了研究者们的视野。转铁蛋白包括存在于血液中的血清转铁蛋白（sTRf）、存在于哺乳动物乳汁中的乳铁蛋白（Lactoferrin）以及存在于禽蛋清中的卵转铁蛋白（Ovotransferrin）。其中乳铁蛋白和卵转铁蛋白来源丰富，具有被开发成新型补铁剂的潜力，而目前已经研究较多的是乳铁蛋白。1960年乳铁蛋白首先在牛乳中以与铁结合的复合物形式被发现，之后人们对其进行了大量研究。到上世纪80年代，牛乳铁蛋白的工业化生产方法就已经建立，并在多个方面进行了商业化的应用。在日本，乳铁蛋白已被商业化应用于食品、化妆品和口腔保健相关产品等多个方面（HiroyukiWakabayashietal.2006）。RosalbaPaesano等（2010）对乳铁蛋白治疗孕妇铁缺乏和IDA的效果进行了评价，结果表明使用乳铁蛋白治疗30天后，患者的各项血液学指标得到了明显改11万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文善，并且血清中的IL-6显著下降，说明乳铁蛋白能够有效抑制炎症的发生，这些均优于作为对照的硫酸亚铁组，说明乳铁蛋白是一种更有效、更安全的补铁剂。目前，工业上乳铁蛋白主要是通过从牛的乳清中分离而得到的，而牛乳中乳铁蛋白的含量比较低，产后第一天的初乳中质量浓度可达到1g/L以上，但是在24h后便降至0.42g/L，再过15h则降至0.22g/L。一般来说个体常乳中乳铁蛋白的质量浓度约为初乳的20%。与乳铁蛋白相比，另一种非常具有潜力的食源性生物蛋白铁——卵转铁蛋白的原料和产量就都丰富得多。卵转铁蛋白占蛋清中蛋白质含量的12%-13%，每100ml蛋清大约能提取出1.1g卵转铁蛋白。对于卵转铁蛋白的研究主要集中在其提取、分离、纯化等基础研究方面，并取得了良好的进展，为其后续商品化打下了坚实的基础。4.蛋白质螯合铁的优势及研究进展4.1蛋白质螯合铁的吸收代谢机理目前国内外对于蛋白铁吸收代谢机理的研究主要集中于乳铁蛋白铁，而对于卵转铁蛋白铁的研究则较少。乳铁蛋白是转铁蛋白家族的一员，其基因一般在粘膜上皮细胞和多形核粒细胞内表达，在哺乳动物体内主要由嗜中性粒细胞产生，而后由多种腺体分泌，广泛存在于乳液（初乳）、唾液、眼泪、胆汁、呼吸道液等分泌液中（CT.Teng.2010;L.Adlerovaetal.2008）。乳铁蛋白在转铁蛋白家族中是最偏碱性的，成年人和牛乳铁蛋白的等电点分别为8.47和8.67。通常条件下，乳铁蛋白在血清中的含量非常低。但在铁过载、炎症、传染性疾病、肿瘤生长等条件下乳铁蛋白一般会增加，这表明嗜中性粒细胞分泌乳铁蛋白受到多种因素的调节（KolbE.1989）。乳铁蛋白具有强大的铁结合能力，并且母乳中含有丰富的乳铁蛋白，而母乳中铁的利用率又很高，这些都暗示着乳铁蛋白可能在婴儿肠道铁吸收过程中起某种促进作用(Iyeretal.1993,Levayetal.1995)。Chierici等（1992）进行的临床实验也表明含有牛乳铁蛋白的婴儿奶粉能够提高血清铁蛋白的水平。之后研究者发现与血清转铁蛋白不同，乳铁蛋白不能与TFR1和TFR2结合，但是它却能够与许多不相关的蛋白家族结合，并且在不同种类的细胞上存在不同的受体。乳铁蛋白受体大体可分为两类：内凝集素-1（HL-1）和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）。12万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价HL-1是存在于肠道内的乳铁蛋白受体，它于1988年第一次在小鼠体内被分离出2+来（W.L.Hu,etal.1988），是一种136kDa的，依赖于Ca的蛋白质（T.Komiya,etal.1998）。它与乳铁蛋白的结合受到pH的调控，在pH为6.0-7.5时最佳，计量比为1:1。HL-1还与脂代谢有关，并在先天免疫系统里扮演独立的角色（Z.H.Lu,etal.2011）。关于HL-1在乳铁蛋白铁代谢中的作用，有研究者认为90%的乳铁蛋白在与HL-1结合之后发生降解，铁离子被释放出来，而剩余的10%则以完整的形式被肠细胞摄取。细胞内铁缺乏则可能会促使肠细胞表面HL-1的表达，从而提高乳铁蛋白结合铁的摄入（L.Adlerovaetal.2008）。此外，有一点尤其值得注意，乳铁蛋白与肠细胞上的受体（HL-1）的结合是种族特异的（Kawakamietal.1991)。LRP是存在于骨、脑、纤维原细胞内的乳铁蛋白受体。乳铁蛋白能够极大地刺激成骨细胞，在骨的形成和恢复中起重要作用。乳铁蛋白能够与LRP1和LRP2在多种组织或器官中结合，比如骨、大脑、纤维原细胞等（T.E.Willnowetal.1992）。值得一提的是LRP1能够与超过三十种与乳铁蛋白无关的蛋白质结合，尤其是与脂蛋白代谢相关的蛋白质(A.P.Lillisetal.2008)。此外，能与乳铁蛋白结合的物质还有CP、骨调素以及人体眼泪、唾液中的组分等。虽然上述现象和研究都暗示着乳铁蛋白具有促进铁吸收的作用，但是对于这一点长久以来一直存在着争议。许多动物实验和人体临床实验的结果都在质疑着乳铁蛋白对铁吸收的促进作用。Ward等（2003）针对乳铁蛋白在铁代谢中的作用做了大量的体内研究。他们首先使用LFKO小鼠研究了乳铁蛋白基因切除对铁平衡的影响，结果表明乳铁蛋白基因的切除并不会导致缺铁性贫血，这说明乳铁蛋白对于婴儿肠道铁吸收并不重要。之后他们又分别对LFKO和野生型小鼠的后代进行了研究，发现LFKO小鼠后代中血清铁含量、转铁蛋白饱和度以及肝脏铁含量较野生型均有升高，并且后两者具有显著差异，这表明LFKO小狗的后代反而展现出了轻微的铁过载。此后他们又针对乳铁蛋白是否对成年个体的铁平衡有影响进行了研究，通过原位杂交分析发现乳铁蛋白在十二指肠中并未内生性表达；而不论摄入基础铁含量的膳食还是高铁含量的膳食，成年LFKO小鼠中的各项铁指标与野生型小鼠没有显著差异。这些实验结果表明小鼠肠道铁的吸收并不需要LF。更进一步讲，LFKO小鼠中轻微的铁过载还暗示着LF在哺乳期具有隔离铁和抑制过量铁吸收的作用。有趣的是一项人体临床研13万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文究表明摄入除去了乳铁蛋白的母乳的婴儿较摄入普通母乳的婴儿铁的吸收更高，这也证明了Ward等人的观点：乳铁蛋白的作用是限制过量铁的吸收，而非促进(Davidssonetal.1994)。此外，一些更早的临床研究也表明乳铁蛋白对婴儿铁吸收并没有显著影响（Fairweather-Taitetal.1987;Schulz-Lelletal.1991）。另外一些研究则指出乳铁蛋白可能存在与受体无关的促进肠道内铁吸收的机制。Paesano等（2006）的临床研究表明在孕妇体内，乳铁蛋白中的铁比FeSO4更容易被吸收。但是乳铁蛋白在进入人体消化道后便会被降解，因此这与HL-1的关系应该不大。而FeSO4（包括其它铁剂）容易导致脂质氧化，从而导致肠道发炎而抑制铁的吸收，而乳铁蛋白能够减少孕妇血清IL-6（白细胞介素-6）的水平（Paesanoetal.2010）。年轻女性对天然乳铁蛋白铁剂和加热变性后的乳铁蛋白铁剂中铁的吸收没有差异（LönnerdalandBryant，2006）,这一事实也说明并不存在某种特殊的铁吸收机制。因此乳铁蛋白最大的优势可能在于其是一种更良性的铁载体，需要胃肠道对其先进行酶解将铁释放出来，而并不存在某种特殊的铁吸收机制。乳铁蛋白促进铁吸收的另一个可能的机制是改善肠道内的微生物菌群。在母乳喂养的婴儿肠道内，微生物菌群主要由双歧杆菌属组成(Fanaroetal.2003),而在成年人体内则主要是厚壁菌门和拟杆菌门（Eckburgetal.2005）。很多双歧杆菌属的细菌并不受乳铁蛋白抑菌作用的抑制，有的甚至会受到促进（Kimetal.2004）。最近的一项研究表明牛奶中添加双歧杆菌能够减少儿童中铁缺乏的发病率（Sazawaletal.2010）。此外由于乳铁蛋白具有强大的Fe结合能力，因此能够抑制那些需要铁元素的细菌的生长，并促进那些Fe需求量低的益生菌的生长，比如乳酸菌。并且有一些证据表明乳铁蛋白能够直接促进这些菌种的生长(Petschowetal.1999)。虽然这种作用的机理还不清楚，但益生菌确实能够减少肠道内感染，这很可能会促进铁的吸收。4.2具有补铁和补充蛋白质等多种生理功能，为多效补铁剂多项研究表明卵转铁蛋白在被胃肠道酶消化后所产生的多肽具有多种生理功能，主要为抗菌（调节胃肠道微生物）、抗氧化和降血压。Ibrahim等（2000）发现源自卵转铁蛋白的多肽OTAP-92能通过破坏细菌的细胞膜从而产生良好的抗菌活性。Moon等（2013）研究发现经胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶等水解后的卵转铁蛋白具有良好的抗氧化活性，并能够有效防止白细胞中的DNA损伤。吴建平和Acero-Lopez（2012）对卵转铁蛋白经酶水解后产生的一种多肽14万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价（Lys-Val-Arg-Glu-Gly-Thr）进行了研究，发现这种多肽具有很强的ACE（血管紧张素转化酶）抑制活性和血管舒张活性；KaustavMajumder等（2013）考察了一种源自卵转铁蛋白的三肽IRW（Ile-Arg-Trp）对自然高血压大鼠（SHR）的治疗效果，结果表明SHR的血压明显降低，并且其余高血压相关各项指标全面改善，其抗高血压效果可能是通过抑制ACE活性、调节内皮型一氧化氮合酶、以及抗炎症活性得以实现的。乳铁蛋白具有抗菌、改善肠道微生物菌群、抗癌、抑制脂质氧化等多种生理活性。乳铁蛋白存在两种不同的抗菌机理，但或多或少都与其隔离铁的能力有关。一种是通过结合铁从而抑制对Fe需求高的细菌生长；另一种是通过铁隔离引起细菌的―抽搐‖行为，从而阻止菌膜的形成，如绿脓杆菌（Singhetal.2002）。此外，Bellamy等（1992）在乳铁蛋白的N端鉴定并分离出一个被称为lactoferricin（Lfc-B）的肽段，该肽段保持乳铁蛋白的生物活性，并且具有比乳铁蛋白更强的抗菌活性。另一种源自N1的抗菌肽也于2004年被鉴定出来，被称为lactoferrampin。除了抗菌活性外，有研究者提出乳铁蛋白能够促进肠道内的乳酸菌的增殖，比如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等，这些益生菌能够保护人体免受其它病原菌的危害（P.Manzonietal.2009；Y.Z.Wangetal.2006）。一项临床研究表明人体摄入牛乳铁蛋白能够降低患结肠癌的风险(T.Kozuetal.2009)。除此之外，也有报道指出乳铁蛋白还能够抑制脂质的氧化（I.Medinaetal.2002）。4.3无毒副作用，为健康补铁剂目前市面上的补铁产品大都具有较重的铁腥味，对胃肠道刺激较大，容易引起机体脂质过氧化，并且会干扰许多其它药物的代谢，如甲状腺素、四环素衍生物、环丙沙星等（FrancoPazzucconiet.al,1996）。由于卵转铁蛋白和乳铁蛋白的C端和N端都能非常牢固地将Fe3+包合起来（结合常数达1023），同时其胃肠道消化所产生的肽具有抗氧化等多种生物活性，因此能有效屏蔽铁腥味，减轻铁离子对胃肠道的刺激，降低呕吐等副作用的发生率，降低机体脂质过氧化的风险。此外，卵转铁蛋白铁剂不会干扰其它药物的代谢，FrancoPazzucconi等（1996）以环丙沙星为代表药物，分别研究了卵转铁蛋白铁剂和葡萄糖酸亚铁对环丙沙星代谢的干扰作用，结果显示葡萄糖酸亚铁导致环丙沙星血药浓度峰值以及血药浓度-时间曲线面积降低50%，而卵转铁蛋白铁剂则对其代谢几乎没有影响。15万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文5.本课题的研究意义与主要研究内容5.1研究意义铁缺乏与缺铁性贫血在世界范围内广泛存在，影响着数亿人口的身体健康，尤其在发展中国家尤为严重。虽然随着经济社会的不断发展，我国人口的铁营养状况已有显著改善，铁缺乏和缺铁性贫血患病率较其它发展中国家低，但仍有相当数量的人口受到铁缺乏和缺铁性贫血的威胁，其中以儿童、青少年、孕妇及未怀孕育龄妇女等对铁需求量大的人群最为严重。新型补铁剂的研究与开发对改善这部分人口的铁营养状况具有重要意义。自17世纪补铁剂出现以来，经过数百年的发展，常用补铁剂的种类已达数十种，但历代补铁剂功能单一，并且具有较重的铁腥味，不易为消费者所接受，很容易引2+起胃肠道不适，使用者很难长期坚持服用，耐受性差；此外，游离的Fe容易导致机体产生内源性自由基，诱发组织氧化。而卵转铁蛋白铁具有来源丰富、天然、高效、感官品质好等特点，并能够在保证补铁效果的同时实现多功能、无（或低）铁味、低毒副作用等。这些特点将使卵转铁蛋白铁成为更易为患者或消费者接受的新一代补铁产品。此外，功能性食品（保健食品）近年来在我国蓬勃发展，据统计我国2007至2012年功能性食品销售额增长幅度达81.22%，居世界各大经济体之首（尤新，2009）。在这一宏观市场背景下，卵转铁蛋白补铁产品具有广阔的市场空间，具备极高的市场价值。5.2主要研究内容（1）采用乙醇一次沉淀法提取Holo-卵转铁蛋白原料，并利用SDS-PAGE、AAS等方法对所提得的Holo-卵转铁蛋白进行鉴定，测定其纯度、得率、铁含量等指标；同时对Holo-卵转铁蛋白在SGF中的消化性能进行评价，并采用磺基水杨酸法检测3+其Fe在SGF中的释放情况。（2）通过动物实验对卵转铁蛋白补铁剂的补铁功效进行评价。设置正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和卵转铁蛋白铁剂组，通过饲喂低铁饲料构建IDA模型，随后对各组进行补铁恢复实验，分别于10d和21d测定实验动物的RBC、Hb、HCT、MCV、RDW、SI、SF、肝脏指数、脾脏指数、肝脏白度等指标，并观察其肝脏颜色。16万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价（3）以动物实验优选出的配方作为主料配方，以粉末直接压片法制备卵转铁蛋白铁片剂产品，对片剂的辅料添加量进行研究，通过单因素实验考察微晶纤维素粒度、硬脂酸镁添加量、微晶纤维素添加量以及交联聚乙烯吡咯烷酮添加量对片剂成型性、硬度、崩解时限、粘冲情况等的影响；随后通过正交实验和验证性实验确定卵转铁蛋白铁片剂的最佳辅料配方。（4）对卵转铁蛋白铁片剂生产项目进行经济技术分析，估算其投资、成本及利润，并分析其投资回收效益和风险，为后续工业化应用提供决策依据。17万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文第二章卵转铁蛋白的提取及相关指标的测定1951年Warner和Weber首先报道了使用乙醇大规模提取卵转铁蛋，其使用的乙醇浓度为50%，在pH6-9的范围内沉淀，但所得产品的纯度比较低。Guerin和Brule（1992）使用阳离子交换色谱的方法（Duolite-C-476和C-464）从除去溶菌酶的鸡蛋清中提取工业规模的卵转铁蛋白，产品的得率和纯度分别达到了54%和97%，但是这个方法非常耗时。2011年，袁小军，马美湖等以配有聚砜树脂衍生物膜的超滤装置为载体，应用两步超滤法分离鸡蛋清中卵转铁蛋白，并对工艺进行了优化。日本的Ko和Ahn（2008）提出一种乙醇提取卵转铁蛋白的新思路，他们首先将蛋清中的无铁卵转铁蛋白用FeCl3进行饱和，使之成为饱和铁卵转铁蛋白，从而使其性质更加稳定，更不容易变性，然后他们通过两次添加乙醇，分别达到除去其它蛋白质和沉淀卵转铁蛋白的目的，之后他们通过添加柠檬酸来调节pH，促使铁从卵转铁蛋白中释放出来，得到无铁卵转铁蛋白，终产品的纯度大于80%。任国栋和马美湖（2012）在Ko和Ahn的研究基础上，对乙醇沉淀法提取中式规模的卵转铁蛋白做了进一步的研究，提出了一种以FeCl3为铁源，先饱和蛋清中的卵转铁蛋白，再通过一步乙醇沉淀来提取卵转铁蛋白的方法，这种方法不仅只需一次乙醇沉淀，并且可以免去调节蛋清pH的过程，简化了提取工艺。本章采用乙醇一次沉淀法提取Holo-卵转铁蛋白，以为后续实验提供充足原料，同时测定其纯度、得率、含铁量等指标，并对其体外消化性能、体外铁离子释放情况等性质进行了表征。1.材料与方法1.1材料1.1.1原料鸡蛋，品种：海兰褐，武汉九峰山养鸡场提供1.1.2试剂乙醇AR国药集团化学试剂有限公司碳酸氢钠AR国药集团化学试剂有限公司氯化钠AR国药集团化学试剂有限公司18万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价氯化铁AR国药集团化学试剂有限公司胃蛋白酶1：10000Amresco胰酶250IU/g阿拉丁氯化钠AR国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾AR国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠AR国药集团化学试剂有限公司碳酸氢钠AR国药集团化学试剂有限公司盐酸AR国药集团化学试剂有限公司电泳试剂盒—谷歌生物科技有限公司邻菲罗啉AR国药集团化学试剂有限公司氟化铵AR国药集团化学试剂有限公司硫酸亚铁铵AR国药集团化学试剂有限公司抗坏血酸AR国药集团化学试剂有限公司磺基水杨酸AR国药集团化学试剂有限公司氨水AR国药集团化学试剂有限公司硫酸铁铵AR国药集团化学试剂有限公司1.1.3仪器与设备搅拌机JK-DMS-ProNI上海麦尚科学仪器有限公司冷冻离心机AvantiJ-EBerkmanCoulter电子天平YP2002上海越科学仪器有限公司旋转蒸发仪RE-2000E上海耀特仪器设备有限公司冷冻干燥机Beta1-8LDplusChristCompany原子吸收吸光光度仪AA-6300C岛津企业管理有限公司紫外可见分光光度仪NanoDrop2000美国themo公司恒温摇床RHQW-60常州市人和仪器厂分析天平AR2140奥豪斯国际贸易有限公司电泳仪DYCZ-25E北京六一超纯水系统OptionS7+ClassicUVF英国ELGA19万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.2方法1.2.1卵转铁蛋白提取工艺流程蛋清等体积清黄分离搅拌30min乙醇沉淀水稀释加FeCl3回收乙醇Holo-OTf粉冷冻干燥上清液旋蒸离心图2-1.卵转铁蛋白提取工艺流程Fig2-1.Processflowoftheextractionofovotransferrin1.2.2蛋重测定每一批样品提取前，测定所用原料蛋的重量。1.2.3SDS-PAGE测定卵转铁蛋白的纯度安装夹心式玻璃板：将干燥的玻璃板装入配套的夹套中，垂直固定在卡槽上，检查装置是否漏水，若漏水则需重新固定。配胶：采用SDS-PAGE不连续系统，分离胶浓度12%、浓缩胶浓度5%，具体凝胶配方见表2-1。表2-1.SDS-PAGE凝胶配方Table2-1.IngredientsofSDS-PAGEgel分离胶（12%）浓缩胶（5%）双蒸水3.3ml2ml30%丙烯酰胺（29:1）4ml0.5ml1.5MTRIS-HCl（pH8.8）2.5ml—1MTRIS-HCl（pH6.8）—0.5ml10%SDS0.1ml40μlAP0.1ml30μlTEMED5μl4μl总体积10ml3ml20万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价制备凝胶：先将配置好的分离胶缓慢沿长玻璃板加到两块玻璃板之间，加至距短板上沿2-3cm处，以少量双蒸馏进行水封，待胶体凝固后倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。然后加入配置好的浓缩胶，直至距离短玻璃板上沿约0.3cm处，插入梳子，用少量蒸馏水覆盖，待胶体凝固后，加入电极缓冲液，然后拔去梳子。样品处理及上样：取适量Holo-OTf粉末溶于双蒸水中，使其浓度为2mg/ml。用移液枪取80μl蛋白质溶液，加入20μl的上样缓冲液，混匀，置于沸水中煮沸3-5min，冷却置室温，然后用微量进样器上样。Marker用微量进样器直接上样。电泳：将制备好的凝胶连同玻璃板一起放入电泳槽中，在电泳槽外侧及上槽中注入电极缓冲液，外侧电极缓冲液淹没电极约2mm，链接电极，打开电泳仪，设置相关参数（浓缩胶电压80V，分离胶电压120V），开始电泳。当溴酚蓝染料迁移至玻璃板底部时，停止电泳。固定、染色及脱色：将配置好的固定液倒入培养皿中，固定30min；然后弃去固定液，加入染色液，室温下在振荡器上染色30-40min；染色完成之后先用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色3-4次，直至背景色去除。分析及计算：采用Gel-proanalyzer对电泳图进行分析，鉴定蛋白质纯度，并计算得率。1.2.4火焰原子吸收法测定卵转铁蛋白粉中的铁含量标准曲线的制作：准确称取硫酸铁铵0.2159g，先用少量0.5MHNO3溶解，然后移入250ml容量瓶中，并用0.5MHNO3稀释至刻度，溶液中Fe浓度为0.1mg/ml。取上述Fe浓度为0.1mg/ml的溶液5ml，用0.5MHNO3稀释10倍，得到Fe浓度为0.01mg/ml的Fe标准溶液。分别取上述Fe标准溶液2.5、5、7.5、10、12.5，15ml于50ml容量瓶中，用0.5MHNO3稀释至刻度，摇匀，用火焰原子吸收仪测定吸光度，同时做空白。样品处理：精确称取各批次卵转铁蛋白粉末0.5g于消化管中，加混合酸（硝酸：高氯酸=4:1）消化液15ml，放置过夜，于消化炉上进行消化，直至冒大量白烟，消化液呈无色透明或略带黄色为止。消化完成后将溶液转移至250ml容量瓶中，并21万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文用0.5MHNO3溶液冲洗消化管数次，将洗液一并转移至容量瓶中，然后用0.5MHNO3溶液定容至刻度，用火焰原子吸收仪测定吸光度，同时做空白。1.2.5体外模拟消化实验溶液的配置：4×模拟胃消化液的配置（SGF）：称取0.2gNaCl和660mg胃蛋白酶，加入70mL去离子水，加入730μL盐酸，再用盐酸调pH至1.2，加水定容至100mL。样品蛋白溶液的配置：称取5mg卵转铁蛋白，定容于1m去离子水中，混匀，用于模拟胃消化实验。模拟胃消化实验操作步骤：反应时间设置为0s、5s、15s、2min、30min、1h、1.5h、2h，并以胃蛋白酶作为对照。反应时间为0s的模拟胃消化实验：在1.5mL离心管中加入190μLSGF，37℃恒温水浴振荡5min。加入10μL样品蛋白溶液，同时加入266μL0.2mol/L碳酸氢钠溶液，漩涡振荡后，冰浴，加入70μL蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5min，取出后冷却至室温备用。反应时间为5s、15s、2min、30min、1h、1.5h、2h的模拟胃消化实验：在10mL离心管中加入1.9mLSGF，37℃恒温水浴振荡5min。加入100μL样品蛋白溶液，迅速振荡并快速置于37℃水浴，准确记录时间，在每个反应时间点，迅速吸取反应液200μL，加入1.5mL离心管中（含有266μL0.2mol/L碳酸氢钠溶液），冰浴，加入70μL蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5min，取出后冷却至室温备用。胃蛋白酶对照：在1.5mL离心管中加入190μLSGF，再加入10μL去离子水和266μL0.2mol/L碳酸氢钠溶液，充分振荡后，加入70μL蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5min，取出后冷却至室温备用。SDS-PAGE电泳鉴定：将制备好的消化后的蛋白样品按照1.3.2中步骤处理后，进行分离胶浓度15%的SDS-PAGE电泳，判断其消化性能。3+1.2.6Holo-卵转铁蛋白在SGF中Fe的释放情况3+Fe标液的配制：称取硫酸铁铵0.2159g，少量水溶解后加入2.5ml25%的硫酸，3+3+移入250ml容量瓶中，去离子水定容，Fe浓度为0.1mg/ml。取上述Fe浓度为3+3+0.1mg/ml的溶液5ml，稀释10倍，得到Fe浓度为0.01mg/ml的Fe标准溶液。22万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价3+3+Fe标曲的制作：分别取Fe标液0.25、0.5、1、1.5、2ml于50ml容量瓶中，加入10ml模拟胃液(SGF)，14ml0.2mol/LNaHCO3溶液，充分搅拌后再加入5ml磺基水杨酸，1.5ml氨水（1+1），去离子水稀释至刻度，摇匀，测定其吸光度，以试剂做空白。模拟胃消化液中结合铁卵转铁蛋白释放铁情况的检测：分别取1ml10g/L卵转铁蛋白铁溶液于6个反应器中，并各加入10ml模拟胃液，于37℃条件下进行反应，分别于5s、15s、2min、5min、15min、30min加入14ml0.2mol/LNaHCO3溶液终止反应，充分搅拌后加入5ml磺基水杨酸，1.5ml氨水（1+1），然后将溶液转移至50ml容量瓶中，去离子水稀释至刻度，摇匀，测定其吸光度，以试剂做空白，共作3次平行。2.结果与分析2.1SDS-PAGE测定卵转铁蛋白的纯度图2-2.各批次Holo-卵转铁蛋白SDS-PAGE电泳情况Fig2-2.SDS-PAGEelectrophoresisofholo-ovotransferrinfromdifferentbatches表2-2.各批次Holo-卵转铁蛋白纯度和得率Table2-2.Purityandyieldofholo-ovotransferrinfromdifferentbatches批次指标第一批第二批第三批第四批第五批平均值纯度55.49%54.21%55.07%54.83%54.91%54.90±0.46%得率92.04%92.80%90.69%89.86%90.80%91.24±1.17%23万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文图2-2所示为所提取的5个批次的Holo-卵转铁蛋白SDS-PAGE电泳情况，位于第四条marker位置的是Holo-卵转铁蛋白，位于第四和第六条marker之间的可能是未沉淀完全的卵白蛋白等杂蛋白，而位于第七和第八条marker之间的是产品中主要的杂蛋白卵类粘蛋白。由于提取出来的Holo-卵转铁蛋白是用于产品开发而非理论研究，故以其得率为主要考虑因素，同时兼顾其纯度。经凝胶电泳分析软件（Gel-proanalyzer）分析鉴定，提取所得卵转铁蛋白纯度为54.9±0.4%；经计算得其得率为91.24±1.05%，具体见表2-2。2.2火焰原子吸收法测定卵转铁蛋白粉中的铁含量图2-3所示标准曲线的最小二乘拟合回归方程为y=0.1398x-0.0041，相关系数平2方R=0.9974。表2-3所示是所提取的5个批次样品中的铁含量，其均值为0.965±0.034mg/g蛋白质，各批次之间差异不显著（P>0.05），并接近于生产工艺设定值1mg/g蛋白质，表明Holo-卵转铁蛋白提取工艺较稳定。第二批次蛋白铁含量相对较低，这可能是由于蛋白质提取和铁测定过程中损失率较高，或者是由于铁测定过程中取样不均匀所致。0.45y=0.1398x-0.00410.42R=0.99740.350.30.250.20.15吸光度(Abs)0.10.050-0.0500.511.522.533.5浓度(μg/ml)图2-3.火焰原子吸收法测定铁含量标准曲线Fig1-3.StandardcurveofironcontentdeterminationbyAAS表2-3.各批次Holo-卵转铁蛋白中的铁含量Table1-3.Ironcontentofholo-ovotransferrinfromdifferentbatches批次指标第一批第二批第三批第四批第五批平均值铁含量/mg0.99320.97021.00631.01161.00661.00±0.1724万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价2.3体外模拟胃消化实验2.3.1体外模拟胃消化SDS-PAGE电泳情况图2-4.Holo-卵转铁蛋白体外模拟胃消化SDS-PAGE电泳图Fig2-4.SDS-PAGEelectrophoresisofholo-ovotransferrinundergoinggastricdigestioninvitro参考国标（黄昆仑等，2007）的方法对Holo-卵转铁蛋白进行模拟胃消化，判断其胃消化稳定性，SDS-PAGE电泳结果见图2-4。如图所示，第三泳道中处于第3、4条marker之间的蛋白是卵转铁蛋白，位于第6、7泳道之间的是样品中主要的杂蛋白——卵类粘蛋白；第二泳道中位于第6条marker位置的蛋白是胃蛋白酶对照。从图中可以看出样品中的Holo-卵转铁蛋白和卵类粘蛋白均在5S内被消化完全，消化性能非常好。3+2.3.2Holo-卵转铁蛋白在模拟胃液中释放Fe的情况3+为探究Holo-卵转铁蛋白中Fe在模拟胃液中的释放情况，研究者采用磺基水杨3+酸法对模拟胃液中的Fe进行了动态检测。磺基水杨酸是一种常用显色剂，能够极3+e3+灵敏地与Fe结合，在pH=8-11时与F结合生成黄色络合物，该络合物的最大吸收波长为420nm，并在15分钟内保持稳定。3+JohnC.Dewan等（1993）对卵转铁蛋白N端（与Fe结合）的晶体X衍射结构3+图进行了研究，结果表明卵转铁蛋白N端Fe的释放与金属位点附近的―双赖氨酸（Lys）诱发器‖有关；当卵转铁蛋白处于酸性环境中时，Lys发生质子化作用，两个3+Lys之间的氢键断裂，蛋白质构象由闭合变为开放，Fe被释放。Abdallah和Hage25万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文3+Chahine（1999）对酸性环境下卵转铁蛋白（holo-andmonoferric）Fe释放的动力学3+过程进行了研究，表明Holo-卵转铁蛋白N端中Fe的释放在10s内完成，远快于C3+3+端中Fe的释放（400s—4000s）；同时C端Fe的释放明显存在对某些阴离子的依赖（柠檬酸根离子、醋酸根离子等）。1995年HiroufmiKurokwa等报道了卵转铁蛋白铁结合位点处的结构为两个酪氨酸残基(Tyr)、一个组氨酸残基(His)和一个天冬氨酸残基(Asp)，以及可以提供双齿配体的伴阴离子CO32-(或HCO3-)，它们共同组成3+六配位的八面体结构；卵转铁蛋白的这种结构能够非常牢固地与Fe+结合，结合常数高达1023（TaniguchiT,IchimuraKandKawashimaSetal.,1990）。3+磺基水杨酸法测定消化液中Fe浓度标准曲线见图2-5，其线性回归方程为y=23+0.4037x+0.0047，相关系数平方R=0.9971。SGF中Fe的释放情况见图2-6。消化3+3+时间为0s时Fe浓度为0.058（±0.006）μg/ml，这部分Fe主要来自原料制备过程3+3+中所添加的过量的Fe；消化时间为5s时Fe浓度为0.129（±0.007）μg/ml，结合3+上述分析，研究者认为这部分Fe主要是来自卵转铁蛋白的N端（可能少部分来自C端），是由酸性环境介导和胃蛋白酶水解协同作用而释放的；随后在5s-2min的时3+3+间内，胃蛋白酶的水解作用占据主要位置，Fe结合位点被破坏，促使Fe释放；3+3+3+2min时Fe浓度为0.190（±0.005）μg/ml，之后Fe浓度基本维持稳定，说明Fe在2min时已基本释放完全。0.25y=0.4037x+0.00472R=0.99710.20.150.1吸光度（Abs）0.05000.10.20.30.40.50.6浓度（μg/ml）3+图2-5.磺基水杨酸法测定模拟胃液中Fe标准曲线3+Fig2-5.StandardcurveofthedeterminationofFeinSGFusingSSA26万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价0.250.20.150.1Fe离子浓度(μg/ml)0.0500s5s15s2min5min15min消化时间图2-6.模拟胃液中铁离子释放情况3+Fig2-6.ReleasesituationofFeinSGF2.4卵转铁蛋白相关指标汇总及成品展示表2-4.各批次卵转铁蛋白指标汇总Table2-4.Collectionofindicatorsofovotransferrinfromdifferentbatches批次指标第一批第二批第三批第四批第五批平均值蛋重/g4828.544814.324782.534861.744805.394818.50±29.38OTf粉重/g57.3659.2056.9556.6757.1857.47±1.00纯度%55.4954.2155.0754.8354.9154.90±0.46得率%92.0492.8090.6989.8690.8091.24±1.17OTf含量/g31.8332.0931.3631.0731.4031.55±0.41铁含量/mg0.99320.97021.00631.01161.00661.00±0.17图2-7.Holo-卵转铁蛋白成品Fig2-7.Endproductofholo-ovotransferrin27万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文提取所得卵转铁蛋白粉末如图2-7所示，为橘红色粉末，粉末中主要成分为Holo-卵转铁蛋白，主要杂蛋白为卵类黏蛋白。表2-4所示为所提取卵转铁蛋白的各项指标。3.小结与讨论本章通过SDS-PAGE对提取的5批Holo-卵转铁蛋白进行了鉴定，结果表明所得卵转铁蛋白粉中主要杂蛋白为卵类黏蛋白；后采用Gel-proanalyzer对卵转铁蛋白的纯度、得率等指标进行了分析，提取所得卵转铁蛋白纯度为54.9±0.4%；经计算得其得率为91.24±1.05%。采用火焰原子吸收法测定了提取所得卵转铁蛋白粉末中的铁含量，结果显示5个批次样品中的铁含量均值为0.965±0.034mg/g蛋白质，各批次之间差异不显著（P>0.05），表明所采用的提取方法所得卵转铁蛋白中铁含量较稳定。基于卵转铁蛋白在人体肠道内没有特殊受体这一事实，考虑其补铁功效的实现3+需要在胃肠道内蛋白酶的作用下，将其结构破坏，使其中的Fe释放出来，研究者又对提取所得卵转铁蛋白进行了体外模拟消化实验，对其在SGF中的消化性能进行了评价，结果表明Holo-卵转铁蛋白在SGF中于5s内被分解完全，消化性能极好；3+随后，又采用磺基水杨酸法对卵转铁蛋白在SGF中的Fe释放情况进行了检测，结3+果表明Fe在2min的时间内基本释放完全。最后，研究者对提取所得卵转铁蛋白的纯度、得率、铁含量等各项指标进行了汇总。28万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价第三章卵转铁蛋白铁及其配方产品的补铁功效评价本章通过动物实验对卵转铁蛋白及其配方产品的补铁功效进行评价。目前国内外对于卵转铁蛋白铁的补铁功效研究相对较少。此前，山西大学的宗艳等（2007）对卵转铁蛋白补铁剂进行了研究，通过小鼠实验证明了该补铁剂对缺铁性贫血具有良好补血作用，RBC等指标明显优于对照组，并且具有明显的抗氧化和抗脂质过氧化的作用。江西农业大学的杜华英等（2010）同样通过小鼠实验对卵转铁蛋白铁制剂的补铁效果进行了研究，结果表明卵转铁蛋白铁制剂组的Hb、RBC、HCT等指标与模型组差异极显著，补铁效果良好。但是这些研究在所选取的实验动物、评价指标等方面均存在一定的局限，卵转铁蛋白铁的补铁功效还有待进一步评价。本次研究者选取大鼠为实验动物，将其分为正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、OTf-Fe组以及两个配方组，在建立IDA（缺铁性贫血）模型的基础上，对阳性对照组、OTf-Fe组以及两个配方组进行补铁恢复实验，分别于补铁10d、21d称重、取血（21d时加取肝脏、脾脏），并测定相关指标。1.材料与方法1.1材料1.1.1原料铁结合卵转铁蛋白粉，自制，纯度54.9%，铁含量0.965mg/g蛋白质富马酸亚铁，纯度93%，铁含量32.5%，购自郑州瑞普生物工程有限公司葡萄糖酸亚铁、纯度95%，铁含量11.5%，购自郑州瑞普生物工程有限公司L-抗坏血酸，纯度97%，购自郑州瑞普生物工程有限公司阿胶、大枣、枸杞子，均购自北京同仁堂（武汉）1.1.2动物与饲料Wistar大鼠，雌性，SPF级，4周龄，购自湖北省疾病预防控制中心普通饲料，铁含量45ppm，购自南通特洛菲饲料科技有限公司缺铁饲料，铁含量12ppm，购自南通特洛菲饲料科技有限公司29万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.1.3试剂戊巴比妥钠ARGermanyCompany液体火棉胶AR阿拉丁试剂有限公司无水乙醇AR国药集团化学试剂有限公司生理盐水500ml上海百特医疗用品有限公司甲醛AR国药集团化学试剂有限公司高锰酸钾AR国药集团化学试剂有限公司EDTAK2抗凝管0.5ml江苏康健医疗用品有限公司SFElisa试剂盒48T南京建成生物工程研究所SI试剂盒50T南京建成生物工程研究所去离子水—自制1.1.4仪器与设备超纯水系统OptionS7+ClassicUVF英国ELGA全自动血液分析仪HmXBeckmanCoulter台式离心机TGL-16C上海安亭科学仪器厂微型旋涡混合器WH-2上海沪西分析仪器有限公司水浴锅TL-420D江苏天力建设有限公司酶标仪RT-2100C深圳雷杜生命科学股份有限公司真空泵2XZ-2杭州宝一工业泵有限公司紫外可见分光光度计UV-5501深圳杰创立仪器有限公司制冰机IMS-40雪科电器有限公司恒温培养箱DRP-9032上海森信实验仪器有限公司天平JY1002上海良平色度仪CR-400柯尼卡美能达30万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价1.2方法1.2.1实验动物SPF级雌性初断乳Wistar大鼠42只，4周龄，健康状况良好，血象正常，平均体重76.57±9.49g。所有大鼠均采用不锈钢笼饲养，动物房温度维持在25±1℃，相对湿度维持在50%±5%，光暗周期为12h，自由进食和饮水。1.2.2动物饲料低铁饲料采用美国营养学会(AmericanInstituteofNutrition)推荐的AIN-93G纯化饲料配方（Medinaetal.,2002），将配方中的铁源去除，将酪蛋白替换成蛋清蛋白，铁含量≤12ppm，具体配方见表3-1。普通饲料同样采用AIN-93G纯化饲料配方（全价），添加柠檬酸铁，铁含量45ppm。表3-1.AIN-93G大鼠低铁纯化饲料配方Table3-1.CompositionofpurifiedfeedwithnoaddedironbasedonAIN-93G成分含量(g/kg)成分含量(g/kg)玉米淀粉397.486混合矿物盐**35.00010.000蛋清蛋白*200.000混合维生素***糊化玉米淀粉132.000L-胱氨酸3.000蔗糖100.000酒石酸胆碱2.500大豆油70.000叔丁基对苯二酚0.014纤维素50.000*亦可使用EDTA处理的酪蛋白（蛋白质含量≥85%）**AIN-93G混合矿物盐配方（g或mg/kg预混料）：无水碳酸钙（40.04%Ca）357.00；磷酸一钾（22.76%P,28.73%K）196.00；一水合柠檬酸三钾（36.16%K）70.78；氯化钠（39.34%Na,60.66%Cl）74.00；硫酸钾(44.87%K,18.39%S)46.60；氧化镁(60.32%Mg)24.00；碳酸锌(52.14%Zn)1.65；九水合硅酸钠(9.88Si)1.45；碳酸锰(47.9%)0.63；碳酸铜(57.47%Cu)0.30；碘酸钾(59.3%I)0.01；十二水合硫酸铬钾(10.42%Cr)0.275；硼酸（17.5%B,mg）81.50；氟化钠（45.24%F,mg）63.50；碳酸镍(45%Ni,mg)31.80；氟化锂(16.38%Li,mg)17.40；无水硒酸钠(41.79%Se,mg)10.25；钼酸铵（54.34%Mo）；钒酸铵（43.55%V）；蔗糖粉221.026。***AIN-93G混合维生素配方（g/kg预混料）：尼克酸3.000；泛酸钙1.600；维生素B6-HCl0.700；维生素B1-HCl0.600；核黄素0.600；叶酸0.200；维生素H（生物素）0.020；甘露醇（含0.1%维生素B12）2.500；维生素E（醋酸生育酚，500IU/g）15.000；维生素A（全反式视黄醇棕榈酸酯，500,000IU/g）0.800；维生素D3(400,000IU/g)0.250；维生素K10.075；蔗糖粉974.655。31万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.2.3四组补铁剂的组成FeSO4组：FeSO4溶于去离子水得到，FeSO4浓度0.36mg/ml；OTf-Fe组：铁结合卵转铁蛋白溶于去离子水得到，卵转铁蛋白浓度0.14g/ml；复合配方1组：由铁结合卵转铁蛋白、富马酸亚铁、L-抗坏血酸、阿胶以及大枣、枸杞水提物复方组成，其中铁结合卵转铁蛋白浓度0.14g/ml，富马酸亚铁浓度1.48mg/ml，L-抗坏血酸浓度17.29mg/ml，阿胶浓度0.1g/ml，大枣和枸杞水提物浓度浓度0.1g/ml；复合配方2组：由铁结合卵转铁蛋白、葡萄糖酸亚铁、L-抗坏血酸、阿胶以及大枣、枸杞水提物复方组成，其中铁结合卵转铁蛋白浓度0.14g/ml，葡萄糖酸亚铁浓度4.19mg/ml，L-抗坏血酸浓度17.29mg/ml，阿胶浓度0.1g/ml，大枣和枸杞水提物浓度0.1g/ml。四组补铁剂的Fe浓度均为0.13mg/ml。1.2.4中药选取依据《神农本草经》将大枣、阿胶均列为上品，记载于上经之中，而“上药一百二十种，为君，主养命以应天，无毒，多服、久服不伤人。”，这表明其药性温和，无毒副作用，适于长期服用，是作为保健食品的优良原料。按照《神农本草经》中记载，大枣味甘平，主心腹邪气，安中养脾肋十二经，平胃气，通九窍，补少气、少津液、身中不足、大惊、四肢重，和百药，久服轻身长年，叶覆麻黄，能令出汗，生平泽，可起到补中益气的功效；阿胶味甘平，主心腹，内崩，劳极，洒洒如疟状，腰腹痛，四肢酸疼，女子下血安胎，久服轻身益气，可起到气血双补的功效。而枸杞子味甘平，可滋补肝肾，益精明目，是被认可的具有滋补功效的药食两用资源。将这三种中药按照一定比例与卵转铁蛋白进行复方，可在补铁的同时达到气血双补的效果。1.2.5IDA模型的建立根据体重从42只大鼠中随机选取6只作为正常对照组，全程饲喂普通饲料，饮自来水；其余36只作为建模组，饲喂低铁饲料4周，饮去离子水，建立IDA模型。所有大鼠每5天（饲养初期3天）称量一次体重，4周后所有大鼠尾静脉取血，测32万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价定RBC、Hb、HCT、MCV、RDW等指标，以Hb<100g/L为建模成功的标准，从建模组36只大鼠中选取30只作为后续实验动物。1.2.6补铁期实验方案表3-2.补铁期各组每日灌胃情况Table3-2.Dailyintragastricadministrationduringtheironsupplementaryperiod灌胃物质及剂量（ml/100g体重）富马酸葡萄糖L-抗坏大枣、枸杞组别大鼠数量（只）去离子水FeSO4OTf-Fe亚铁酸亚铁血酸阿胶水提物正常对照组61.5阴性对照组61.5阳性对照组61.5OTf-Fe组61.5复合配方1组60.750.20.150.20.2复合配方2组60.750.20.150.20.2IDA模型建立以后，根据建模组大鼠的Hb水平和体重将其随机分为阴性对照组、阳性对照组、OTf-Fe组、复合配方1组和复合配方2组。在补铁恢复期间，除正常对照组外，其余各组继续饲喂低铁饲料，饮去离子水。阳性对照组灌胃FeSO4，OTf-Fe组灌胃卵转铁蛋白铁溶液，复合配方1组和复合配方2组灌胃配方混合物溶液，各组灌胃剂量均为2mg/kg·d（以Fe计），正常对照组和阴性对照组均灌胃去离子水，各组灌胃体积均为1.5ml/100g，每日灌胃1次，连续3周。补铁恢复期间所有大鼠每5天称量一次体重，根据体重调整灌胃剂量。末次给药后，所有大鼠禁食不禁水10h，2%戊巴比妥钠麻醉（ip），颈静脉取血，测定全血、血清各项指标，取肝脏、脾脏，测定相关指标。具体灌胃情况见表3-2。1.2.7样本的采集和处理1.2.7.1全血的采集和处理采集的全血置于0.5mlEDTAK2抗凝管中，反复颠倒5-10次。采血过程中血液保存于4℃冰箱，待全部动物采血完毕后马上送检（当天），送检过程中血液保存于冰盒中。33万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.2.7.2血清的制备和处理将采集的血液注入2ml离心管中（不添加抗凝剂），置于37℃恒温培养箱1小时，使其充分凝固，然后置于4℃冰箱中过夜，3000rpm/min离心20min，用1ml吸管小心吸取上清液。制备好的血清马上送检（次日），送检途中保存于冰盒中。1.2.7.3脏器的采集和处理用手术剪将动物的腹腔剖开，小心取出肝脏和脾脏，用生理盐水多次冲洗，滤纸吸干，准确称取重量，备测相关指标。1.2.8指标的测定1.2.8.1全血指标的测定全血RBC、Hb、HCT、MCV、RDW均使用BeckmanCoulterHmX全自动血液分析仪进行测定。1.2.8.2血清铁蛋白（SF）的测定采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（Elisa）进行测定，其主要原理是：向预先包被了大鼠铁蛋白（Ferritin）单克隆抗体的酶标孔中加入铁蛋白，温育；温育后，加入生物素标记的抗Ferritin抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅与样品中大鼠铁蛋白的浓度呈正相关。最后使用酶标仪测定吸光度，绘制标准曲线，求得样本中的Ferritin含量。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2.8.3血清铁含量（SI）的测定采用双吡啶比色法进行测定，其主要原理是：在酸性溶液和还原剂的作用下，使转铁蛋白中的铁与蛋白分离，使血清中的高铁还原成亚铁，后者与双吡啶结合成粉红色的络合物，在一定范围内，铁离子的多少与色泽成正比。1.2.8.4肝脏指数、脾脏指数的测定肝质量(g)肝脏指数(%)100（3-1）体质量(g)脾质量(g)脾脏指数(%)100（3-2）体质量(g)34万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价准确称取动物肝脏、脾脏质量和体质量，按照公式3-1和公式3-2分别计算肝脏指数和脾脏指数（张晓鸣等，2008）。1.2.8.5肝脏白度的测定使用柯尼卡美能达CR-400色度仪测定肝脏的L、a、b值，然后按照Hunter白度公式（见公式3-3）计算肝脏的白度。222白度100-(100-L)ab（3-3）1.2.9数据处理和统计分析所有数据均以x±s给出，使用SPSSStatistics17.0统计分析软件对数据进行方差分析，采用Duncan多重比较对数据进行显著性分析。35万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.2.10动物实验设计示意图雌性初断乳Wistar大鼠42只称重根据体重，随机选取6只剩余36只正常对照组IDA模型组全饲程喂饲低喂每5天（饲养初期3天）称量一次体重铁普饲通料4饲料周，，饮饮自去来4周后尾静脉取血，测定Hb等指标离水子水选取Hb<100g/L大鼠30只，根据Hb和体重随机分组Ovo正阴硫复复常性酸-Fe合合对对亚配配照照铁组方1方2组组组组组补铁10d测定血清各项指标测定全血各项指标补铁21d测定脏器各项指标分析各项指标，评价三组卵转铁蛋白补铁剂的补铁功效图3-1.动物实验设计示意图Fig3-1.Schematicdiagramofanimalexperimentdesign36万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价2.结果与分析2.1IDA模型的建立2.1.1建模期大鼠的体重增长情况250.00200.00正常组体重g150.00/建模组体重体重100.0050.000.00饲养时间/d0d3d6d11d16d21d28d图3-2.建模期大鼠体重增长情况Fig3-2.Increaseofrats’bodyweightduringmodeling如图3-2所示，在IDA模型建立期间正常组大鼠和建模组大鼠生长情况良好，建模结束时两组体重分别增加了115.80g和113.62g，增长幅度分别为149.63%和148.72%，两组体重增长情况差异不显著（P＞0.05）。2.1.2建模结束时正常组与IDA模型组全血指标情况表3-3.正常组与IDA模型组全血指标比较（x±s）Table3-3.ComparisonofwholebloodindicatorsbetweennormalgroupandIDAgroup全血指标RBCHbHCTMCVRDW组别12(%)(fl)(%)(10个/L)（g/L）正常组6.54±0.26148.75±6.9036.93±2.3756.43±2.1411.75±0.81IDA模型组4.35±0.25**85.79±4.85**20.60±1.44**45.32±0.8**38.24±1.80**注：表中**表示与正常组相应指标比较差异极显著（P＜0.01）。缺铁性贫血为典型的低色素小细胞型贫血，其表现为RBC、Hb、HCT、MCV值的显著降低和RDW值的显著升高。由表3-3可以看出，IDA模型组上述五项指标较正常组均具有极显著差异（P<0.01），并且所有动物的Hb值均降低至100g/L以下（数据未给出）。由此可以判定IDA模型构建成功。37万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文2.1.3建模分组后各组生理指标情况表3-4.IDA模型建立后各组生理指标情况（x±s,n=6）Table3-4.PhysiologicalindicatorsofallgroupsafterIDAmodelwasestablished生理指标RBCHbHCTMCVRDWBW组别12(10个/L)（g/L）(%)(fl)(%)（g）BbBbBbBbAaa正常对照组6.54±0.26148.75±6.936.93±2.3756.43±2.1411.75±0.81193.19±11.95AaAaAaAaBba阴性对照组4.42±0.3787.20±6.7220.96±2.0545.38±0.9038.06±2.51189.76±17.26AaAaAaAaBbaFeSO4组4.22±0.2184.00±3.0319.95±1.2345.18±0.5339.50±1.45188.88±21.28AaAaAaAaBbaOTf-Fe组4.42±0.7688.00±3.1620.95±1.0745.40±0.7437.72±1.25189.75±7.91AaAaAaAaBba复合配方1组4.32±0.2584.33±6.7420.43±1.5945.33±1.1437.98±2.17190.49±7.57AaAaAaAaBba复合配方2组4.40±0.2485.60±3.8520.82±1.4745.30±0.8737.82±1.43191.25±20.24注：表中大写不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01），不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），字母相同则表示无极显著差异（大写字母）或无显著差异（小写字母），后续图表同。表3-4显示了在IDA模型构建成功之后，根据BW和Hb值对建模组大鼠进行随机分组后各组的生理指标情况。由表中可以看出除正常对照组外，其余五组的RBC、Hb、HCT、MCV、RDW、BW均值非常接近，并且均无显著差异（P>0.05）；而各组与正常组相比较，BW均值十分接近，无显著差异（P>0.05）。由此可见，随机分组效果理想，各组大鼠在进入补铁恢复期前，生理指标无显著差异。2.2补铁期各组大鼠指标测定结果2.2.1补铁期各组大鼠体重增长情况如图3-3所示，各组大鼠在补铁恢复期间生长情况良好，在21d补铁期结束时，各组大鼠体重均值分别达到225.55g、236.35g、226.66g、224.12g、221.36g、230.30g，各组间体重增长情况差异不显著（P>0.05）。38万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价240.00230.00正常对照组阴性对照组220.00硫酸亚铁组g/Ovo-Fe组210.00配方组1体重配方组2200.00190.00180.00饲养时间/d0d5d11d16d21d图3-3.补铁恢复期大鼠体重增长情况Fig3-3.Increaseofrats’bodyweightduringtherecoveryperiod2.2.2补铁期大鼠RBC测定结果表3-5.补铁期大鼠RBC测定结果Table3-5.Determinationresultsofrats’RBCduringironsupplementperiod红细胞计数RBC（1012个/L）分组编号组别补铁前（0d）补铁10d补铁21dBb/AaBc/AaCc/Aa1正常对照组6.54±0.266.66±0.376.80±0.45Aa/AaAa/AaAa/Aa2阴性对照组4.42±0.373.98±0.383.91±0.45Aa/AaBb/BbBCb/Bb3FeSO4组4.22±0.216.16±0.126.17±0.31Aa/AaBbc/BbBb/Bb4OTf-Fe组4.42±0.766.38±0.116.07±0.42Aa/AaBc/BbBCc/Bb5复合配方1组4.32±0.256.65±0.486.74±0.19Aa/AaBbc/BbBCb/Bb6复合配方2组4.40±0.246.28±0.336.33±0.21注：“／”前字母表示各组间（纵向）显著性比较，“／”后字母表示同组不同补铁时间（横向）显著性比较。如表3-5所示，补铁前正常对照组RBC值高于其余各组，差异极显著（P<0.01）；而其余各组间RBC值无显著性差异（P>0.05）。补铁10d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，RBC值明显升高，差异极显著（P<0.01）；其与正常对照组相比，RBC值无显著差异（P>0.05）；与FeSO4相比较，OTf-Fe组、复合配方2组的RBC值与之无显著差异（P>0.05），而复合配方1组则明显高于FeSO4组，具有统计学意义（P<0.05），复合配方1组与复合配方2组的RBC值无显著性差异（P>0.05）。补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组的RBC值高于阴性对照组，差异极显著（P<0.01）；与正常对照组相比，OTf-Fe组的RBC值39万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文较低，差异极显著（P<0.01），复合配方1组、复合配方2组则与之无显著差异（P>0.05）。与FeSO4组相比较，OTf-Fe组和复合配方2组在RBC值上与之差异不显著（P>0.05），而复合配方1组与之差异显著（P<0.05）。此外，复合配方1组的RBC值显著高于OTf-Fe组（P<0.05）。随着补铁时间的延长，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组的RBC值呈上升趋势，补铁前10d增长较快，之后趋于稳定；补铁期结束时，三组大鼠的RBC值较补铁前高，差异极显著（P<0.01）。补铁21d后，OTf-Fe组RBC值与正常对照组相比仍有极显著差异（P<0.01），复合配方2组、FeSO4组RBC值与正常对照组相比有显著差异（P<0.05），而复合配方1组RBC值与正常对照组相比则无显著性差异（P>0.05）。2.2.3补铁期大鼠Hb测定结果表3-6.补铁期大鼠Hb测定结果Table3-6.Determinationresultsofrats’Hbduringironsupplementperiod血红蛋白浓度Hb（g/L）分组编号组别补铁前（0d）补铁10d补铁21dBb/AaCd/AaDc/Aa1正常对照组148.75±6.9147.00±8.37148.83±8.13Aa/AbAa/AabAa/Aa2阴性对照组87.20±6.7279.83±5.2375.67±8.55Aa/AaBb/BbBCb/Cc3FeSO4组84.00±3.03122.83±6.11133.50±4.65Aa/AaBb/BbBb/Bc4OTf-Fe组88.00±3.16119.25±4.65127.33±6.89Aa/AaBc/BbCDc/Bc5复合配方1组84.33±6.74133.25±9.29146.67±5.69Aa/AaBbc/BbCDc/Cc6复合配方2组85.60±3.85125.50±9.57144.00±6.13如表3-6所示，除正常对照组外，其余各组Hb值在同一水平，无显著性差异（P>0.05），而正常对照组Hb值高于其余各组，差异极显著（P<0.01）。补铁10d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，Hb值明显升高，差异极显著（P<0.01）；其与正常对照组比较，Hb值均较低，差异极显著（P<0.01）；与FeSO4组相比，OTf-Fe组与复合配方2组的Hb值与之差异不显著（P>0.05），而复合配方1组的Hb值则明显高于FeSO4组，具有统计学意义（P<0.05）；此外，复合配方1组的Hb值高于OTf-Fe组，差异显著（P<0.05），复合配方1组与复合配方2组的Hb值无显著性差异（P>0.05）。补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复40万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价合配方2组与阴性对照组相比，Hb值明显升高，差异极显著（P<0.01）；与正常对照组相比，OTf-Fe组的Hb值仍较低，差异极显著（P<0.01），复合配方1组合复合配方2组与之相比，Hb值无显著差异（P>0.05）；与FeSO4组相比，复合配方1组和复合配方2组Hb值较高，差异显著（P<0.05），而OTf-Fe组则与之无显著差异（P>0.05）。此外，复合配方1组和复合配方2组的Hb值较OTf-Fe组高，差异极显著（P<0.01）。OTf-Fe组、复合配方1组与复合配方2组的Hb值随补铁时间的延长不断升高，补铁前10天Hb值恢复较快，之后放缓，但仍在继续升高。补铁期结束时，三组大鼠的Hb值较补铁前高，差异极显著（P<0.01）；较补铁10d时高，差异显著（P<0.05）。补铁21天后，与正常对照组相比，OTf-Fe组与FeSO4组的Hb值仍较低，差异极显著（P<0.01）；复合配方1组、复合配方2组Hb值与之无显著性差异（P>0.05）。2.2.4补铁期大鼠HCT测定结果表3-7.补铁期大鼠HCT测定结果Table3-7.Determinationresultsofrats’HCTduringironsupplementperiod红细胞压积HCT（%）分组编号组别补铁前（0d）补铁10d补铁21dBb/AaCd/AaCc/Aa1正常对照组36.93±2.3738.57±2.9639.28±2.76Aa/AbAa/AabAa/Aa2阴性对照组20.96±2.0518.40±1.7817.25±2.32Aa/AaBb/BbBb/Bb3FeSO4组19.95±1.2331.70±0.8932.65±1.63Aa/AaBbc/BbBb/Bb4OTf-Fe组20.95±1.0732.28±1.2432.68±2.39Aa/AaBCc/BbCc/Bb5复合配方1组20.43±1.5935.23±2.9837.90±1.31Aa/AaBbc/BbBb/Bb6复合配方2组20.82±1.4732.53±2.1333.80±1.35如表3-7所示，除正常对照组外，其余各组Hb值在同一水平，无显著性差异（P>0.05），而正常对照组Hb值高于其余各组，差异极显著（P<0.01）。补铁10d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，HCT值明显升高，差异极显著（P<0.01）；其与正常对照组比较，HCT值较低，差异显著（P<0.05）；OTf-Fe组、复合配方2组HCT值与FeSO4组相比，无显著差异（P>0.05），而复合配方1组的HCT值则显著高于FeSO4组（P<0.05）；此外，FeSO4组、OTf-Fe组、复合配41万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文方2组与正常对照组相比，HCT值较低，差异极显著（P<0.01），而复合配方1组与之相比无极显著差异（P>0.01）；复合配方1组与复合配方2组的HCT值无显著性差异（P>0.05）。补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，HCT值明显升高，差异极显著（P<0.01）；与正常对照组相比，OTf-Fe组和复合配方2组的HCT值较低，差异极显著（P<0.01），而复合配方1组HCT值与之相当，无显著性差异（P>0.05）。OTf-Fe组、复合配方2组的HCT值与FeSO4组无显著差异（P>0.05），而复合配方1组的HCT值高于FeSO4组，差异极显著（P<0.01）。此外，复合配方1组的HCT值较OTf-Fe组、复合配方2组高，差异极显著（P<0.01）。OTf-Fe组、复合配方1组与复合配方2组的HCT值随补铁时间的延长呈升高趋势，补铁前10天迅速升高，之后趋于平缓。补铁期结束时，三组大鼠的HCT值较补铁前高，差异极显著（P<0.01）。补铁21天后，与正常对照组相比，OTf-Fe组、复合配方2组、FeSO4组的HCT值较低，差异极显著（P<0.01）；复合配方1组的HCT值则与之无显著性差异（P>0.05）。2.2.5补铁期大鼠MCV测定结果表3-8.补铁期大鼠MCV测定结果Table3-8.Determinationresultsofrats’MCVduringironsupplementperiod平均红细胞体积MCV（fl）分组编号组别补铁前（0d）补铁10d补铁21dBb/AaDd/AaCd/Aa1正常对照组56.43±2.1457.60±1.5957.78±1.89Aa/ABbAa/BbAa/Aa2阴性对照组45.38±0.9046.28±1.1444.03±0.89Aa/AaBCbc/BbBb/Bc3FeSO4组45.18±0.5351.33±0.6552.85±1.06Aa/AaBb/BbBbc/Bc4OTf-Fe组45.40±0.7450.60±1.2753.95±3.09Aa/AaCc/BbBCcd/Cc5复合配方1组45.33±1.1452.90±0.9856.23±1.88Aa/AaBCbc/BbBb/Bb6复合配方2组45.30±0.8751.75±0.9553.40±0.89如表3-8所示，除正常对照组外，其余各组MCV值在同一水平，无显著性差异（P>0.05），而正常对照组MCV值高于其余各组，差异极显著（P<0.01）。铁10d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，MCV值明显升高，差异极显著（P<0.01）；与正常对照组相比，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配42万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价方2组的MCV值均较低，差异极显著（P<0.01）；OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组的MCV值与FeSO4组相比，均无显著差异（P>0.05）；此外，复合配方1组MCV值较OTf-Fe组高，差异极显著（P<0.01），复合配方1组与复合配方2组在MCV值上无显著性差异（P>0.05）。补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，MCV值明显升高，差异极显著（P<0.01）；OTf-Fe组、复合配方2组的MCV值低于正常对照组，差异极显著（P<0.01），而复合配方1组的MCV值则与正常对照组无显著差异（P>0.05）；OTf-Fe组、复合配方2组的MCV值与FeSO4组相比，无显著性差异（P>0.05），而复合配方1组MCV值则明显高于FeSO4组，差异显著（P<0.05）；此外，复合配方1组的MCV值较复合配方2组高，差异显著（P<0.05）。OTf-Fe组、复合配方1组与复合配方2组的MCV值随补铁时间的延长不断升高，补铁前10天MCV值增长较快，之后放缓。补铁期结束时，三组大鼠的MCV值较补铁前高，差异极显著（P<0.01）；OTf-Fe组和复合配方1组的MCV值较补铁10d时高，差异显著（P<0.05）。补铁21天后，与正常对照组相比，OTf-Fe组、复合配方2组、FeSO4组的MCV值仍较低，差异极显著（P<0.01）；而复合配方1组的MCV值则与之无显著性差异（P>0.05）。2.2.6补铁期大鼠RDW测定结果表3-9.补铁期大鼠RDW测定结果Table3-9.Determinationresultsofrats’RDWduringironsupplementperiod红细胞体积分布宽度RDW（%）分组编号组别补铁前（0d）补铁10d补铁21dAa/AaAa/AaAa/Aa1正常对照组11.75±0.8111.95±0.9812.55±1.09Bb/AaCd/AaDd/Aa2阴性对照组38.06±2.5139.35±2.9240.33±1.30Bb/CcBc/BbCc/Aa3FeSO439.50±1.4534.73±1.9229.85±1.89Bb/CcBbc/BbBCb/Aa4OTf-Fe组37.72±1.2532.48±1.9125.52±3.68Bb/CcBb/BbBb/Aa5复合配方1组37.98±2.1730.98±2.5623.80±2.41Bb/CcBbc/BbBCb/Aa6复合配方2组37.82±1.4333.00±1.6826.02±3.44如表3-9所示，除正常对照组外，其余各组RDW值在同一水平，无显著性差异（P>0.05），而正常对照组RDW值低于其余各组，差异极显著（P<0.01）。铁10d43万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，RDW值明显降低，差异极显著（P<0.01）；与正常对照组相比，三组的RDW值仍较高，差异极显著（P<0.01）；与FeSO4组相比，OTf-Fe组、复合配方2组的RDW值与之相当，差异不显著（P>0.05），而复合配方1组的RDW值则显著低于FeSO4组（P<0.05）；复合配方1组与复合配方2组的RDW值无显著性差异（P>0.05）。补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与阴性对照组相比，RDW值明显降低，差异极显著（P<0.01）；与正常对照组相比，三组的RDW值均较高，差异极显著（P<0.01）；与FeSO4组相比，OTf-Fe组、复合配方2组RDW值较低，差异显著（P<0.05）；复合配方1组RDW值较FeSO4组低，差异极显著（P<0.01）。OTf-Fe组、复合配方1组与复合配方2组的RDW值随补铁时间的延长不断降低。补铁期结束时，三组大鼠的RDW值较补铁前低，差异极显著（P<0.01）；与补铁10天时相比，三组大鼠RDW值较低，差异极显著（P<0.01）。补铁21天后，与正常对照组相比，各组大鼠的RDW值均较高，差异极显著（P<0.01）。由上述显著性分析结果可知，在补铁10d后，OTf-Fe组、复合配方1组和复合配方2组均使IDA大鼠的贫血情况得到了非常显著的改善；但与正常对照组相比，多项指标仍存在显著或极显著差异。OTf-Fe组与FeSO4组相比，在补铁10d后，各项指标均无显著性差异，二者补铁效果相当。而复合配方1组与其它组相比，则显示出明显的优势：首先它在RBC、Hb、HCT、RDW四个指标上均显著优于FeSO4组；同时在Hb、MCV两个指标上分别显著和极显著地优于OTf-Fe组；此外它是唯一在HCT值上与正常对照组无极显著差异的一组。最后，复合配方2组与FeSO4组相比或与复合配方1组相比，各项指标均无显著性差异，可以认为复合配方2组的补铁效果介于二者之间，略优于FeSO4组。与补铁10d时相比，补铁21d后，复合配方1组的优势更加凸显，其除RDW之外的各项指标均于正常对照组无显著差异；而与FeSO4组相比较，则五项指标均具有显著或极显著的优势；此外，复合配方1组在RBC、Hb、HCT三项指标上优于OTf-Fe组，差异显著或极显著，在HCT、MCV两项指标上显著或极显著地优于复合配方2组。同时，与补铁10d时相比，复合配方2组表现出了较明显的优势：在Hb和RDW这两个重要指标上显著优于FeSO4组。而OTf-Fe组则与补铁10d时44万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价大致相同，其全血大部分指标较FeSO4组无显著差异，但在RDW值上优于FeSO4组，差异显著。比较不同补铁时期各组大鼠的全血指标情况可知，补充3组卵转铁蛋白铁剂的IDA大鼠的全血各项指标随补充时间的延长不断改善，并且在补铁期前10d各指标增幅（或减幅）较大，之后有所放缓；在补铁恢复期结束时，各组全血指标均得到极显著的改善。在补铁21d后，复合配方1组除RDW值外的各项全血指标均达到正常对照组水平；复合配方2组的Hb值达到正常对照组水平，而其余各项指标与正常对照组相比仍有显著差异（P<0.05）；OTf-Fe组和FeSO4组全血各项指标虽也得到显著改善，但与正常对照组相比仍存在显著差异（P<0.05）。不同补铁时期大鼠全血指标直观比较见图3-4至图3-7。2.2.7不同补铁时期大鼠全血指标直观比较图0d10d21d正常组对照0d10d21d正常组对照50180cd40cbbb30120aa2060bcdad10bbccbaa00RBC(10^12个/L)HCT(%)Hb（g/L）MCV(fl)RDW(%)图3-4.FeSO4组IDA大鼠全血指标恢复情况Fig3-4.RecoveryoftheFeSO4fedIDArats’wholebloodindicators0d10d21d正常组对照0d10d21d正常组对照180.0050dc40bcbb120.0030aa20bcd60.00adcb10bcbcaa00.00jRBC(10^12个/L)HCT(%)Hb（g/L）MCV(fl)RDW(%)图3-5.OTf-Fe组IDA大鼠全血指标恢复情况Fig3-5.RecoveryoftheOTf-FefedIDArats’wholebloodindicators45万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文0d10d21d正常组对照0d10d21d正常组对照50180.00ccbccb40b120.0030aa20bcc60.00adc10bbbbaa00.00jRBC(10^12个/L)HCT(%)Hb（g/L）MCV(fl)RDW(%)图3-6.配方组（1）IDA大鼠全血指标恢复情况Fig3-6.RecoveryoftheOTf-Feformula(1)fedIDArats’wholebloodindicators0d10d21d正常组对照0d10d21d正常组对照50180.00ccc40bbb120.0030aa20bbc60.00adcb10bbcaa00.00jRBC(10^12个/L)HCT(%)Hb（g/L）MCV(fl)RDW(%)图3-7.配方组（2）IDA大鼠全血指标恢复情况Fig3-7.RecoveryoftheOTf-Feformula(2)fedIDArats’wholebloodindicators2.2.8大鼠血清指标测定结果（21d）表3-10.补铁期大鼠血清指标测定结果Table3-10.Determinationresultsofrats’serumindicatorsduringironsupplementperiod组别指标普通对照组阴性对照组FeSO4组OTf-Fe组复合配方1组复合配方2组CcAaBbBbBCcBCbc血清铁含量50.40±10.6519.23±8.6636.47±7.5434.82±9.7746.92±5.3940.45±4.98（μmol/L）CcAaBbBCcCcCc血清铁蛋白28.42±2.7719.50±1.2824.22±1.9326.82±1.2727.47±1.4927.82±2.23（ng/ml）注：结果以x±s给出,n=6，本章后续图表同由表3-10可知，OTf-Fe组、复合配方1组以及复合配方2组的血清铁含量（SI）、血清铁蛋白（SF）与阴性对照组相比较，均存在极显著差异（P＜0.01）。在SI方面，FeSO4组和OTf-Fe组较正常对照组低，差异极显著（P＜0.01），而复合配方1组和复合配方2组与正常对照组相比无显著差异（P>0.05）；同时，复合配方1组的SI较FeSO4组和OTf-Fe组高，差异显著（P<0.05）；OTf-Fe组的SI比FeSO4组的均值46万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价略低，差异不显著（P>0.05）。在SF方面，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组与正常组相比较，差异不显著（P>0.05），而FeSO4组与正常组相比差异极显著（P<0.01）；同时，复合配方1组和复合配方2组的SF值较FeSO4组高，差异极显著（P<0.01），OTf-Fe组SF较FeSO4组高，差异显著（P<0.05）。由上述分析可知，OTf-Fe组、复合配方1组和复合配方2组均能使IDA大鼠的SI、SF得到极显著的改善。在SI方面，复合配方1组与复合配方2组均优于FeSO4组，尤其是复合配方1组，其SI较FeSO4组和OTf-Fe组均有显著的优势；在SF方面，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组均展现出明显的优势，其中复合配方1组和复合配方2组的SF含量极显著地高于FeSO4组，OTf-Fe组也显著高于FeSO4组。2.2.9大鼠肝脏指数和脾脏指数测定结果（21d）表3-11.补铁期大鼠肝脏指数和脾脏指数测定结果Table3-11.Determinationresultsofrats’hepaticindexandspleenindexduringironsupplementperiod组别指标普通对照组阴性对照组FeSO4组OTf-Fe组复合配方1组复合配方2组BcAaABbBbcBcBbc肝脏指数3.10±0.252.56±0.112.83±0.143.00±0.143.11±0.313.05±0.13ABabCcABCbcBCcABabAa脾脏指数0.27±0.030.37±0.070.29±0.020.29±0.030.27±0.040.25±0.05如表3-11所示，在肝脏指数方面，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组的肝脏指数高于阴性对照组，差异极显著（P<0.01），而FeSO4组无极显著差异（P>0.01）；OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组的肝脏指数与正常对照组相比，均无显著差异（P>0.05），而FeSO4组则有显著差异（P<0.05）；同时，复合配方1组肝脏指数较FeSO4组高，差异显著（P<0.05）；OTf-Fe组、复合配方2组肝脏指数与FeSO4组相比，无显著差异（P>0.05）。在脾脏指数方面，复合配方1组和复合配方2组较阴性对照组低，差异极显著（P<0.01），OTf-Fe组与阴性对照组相比，无显著差异（P>0.05）；与正常对照组相比较，复合配方1组和复合配方2组与之无显著差异（P>0.05），OTf-Fe组有极显著差异（P<0.01），FeSO4组有显著差异（P<0.05）；与47万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文FeSO4组相比较，复合配方2组与之有显著差异（P<0.05）；OTf-Fe组、复合配方1组与之无显著差异（P>0.05）；复合配方2组较OTf-Fe组差异极显著（P<0.01）。由上述分析可知，在肝脏指数方面，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组的IDA大鼠均得到了极显著的恢复；其中复合配方1组的恢复情况最好，显著优于FeSO4组；OTf-Fe组和复合配方2组的肝脏指数虽然与FeSO4组无显著差异，但从其与阴性对照组和正常对照组的对比中可以看出，其对肝脏指数的恢复效果是优于FeSO4组的。而在脾脏指数方面，复合配方1组和复合配方2组的IDA大鼠恢复情况更显著，尤其是复合配方2组，其与FeSO4组相比较具有显著的优势；OTf-Fe组有所恢复，但不显著，其恢复作用与FeSO4组大致相当。2.2.10大鼠肝脏白度及色泽测定结果（21d）2.2.10.1大鼠肝脏白度测定结果表3-12.补铁期大鼠肝脏白度测定结果Table3-12.Determinationresultsofrats’hepaticwhitenessduringironsupplementperiod组别指标普通对照组阴性对照组FeSO4组OTf-Fe组复合配方1组复合配方2组AaBbAaAaAaAa白度30.15±1.1734.60±2.2031.58±1.1431.57±1.2431.13±1.3831.76±1.53由表3-12可以知道，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组白度较阴性对照组低，差异极显著（P<0.01），说明其肝脏颜色更深、更暗，血红蛋白含量得到极显著地提高；除阴性对照组外，其余各组肝脏白度差异不显著（P>0.05）。2.2.10.2大鼠肝脏色泽比较48万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价表3-13.补铁期大鼠肝脏色泽比较Table3-13.Comparisonofrats’hepaticcolorduringironsupplementperiod由图3-13可以直观地看出，OTf-Fe组、复合配方1组、复合配方2组的肝脏色泽与正常对照组接近，而与阴性对照组和FeSO4组相比，颜色明显更深、更暗，尤其是复合配方1组和复合配方2组，这表明其肝脏内血红蛋白含量和铁状态得到了更好的恢复。3.小结与讨论卵转铁蛋白铁剂对IDA模型大鼠具有显著的恢复作用，随着补充时间的延长，各项指标逐步改善；补铁前10d，全血各项指标改善幅度较大，之后放缓，在补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组和复合配方2组均能够使IDA大鼠的全血、血清、脏器的各项指标得到极显著的恢复。OTf-Fe组与FeSO4组相比较，在补铁10d时，全血各项指标均无显著性差异（P>0.05），二者补铁效果相当，但与正常对照组相比各项指标均存在极显著差异49万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文（P<0.01）；补铁21d时，全血RBC、Hb、HCT、MCV、SI、肝脏指数、脾脏指数、肝脏白度与FeSO4组相比较均无显著差异（P>0.05），SF较FeSO4组高，RDW值较FeSO4组低，差异显著（P<0.05），肝脏颜色较FeSO4组深，与正常对照组相比，全血各项指标、SI、脾脏指数仍存在显著差异（P<0.05），肝脏颜色较正常组浅。单独补充OTf-Fe的补铁效果略优于FeSO4，但其大部分指标与正常组水平仍存在显著差异。复合配方1组在补铁10d后便显示出明显的优势，它在RBC、Hb、HCT、RDW四个指标上均显著优于FeSO4组（P<0.05），同时在Hb、MCV两个指标上分别显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）地优于OTf-Fe组，但此时其与正常对照组的多项指标仍存在显著或极显著差异。补铁21d后，复合配方1组的优势更加凸显，与FeSO4组相比较，全血各项、SI、SF、肝脏指数、肝脏色泽均具有显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）的优势，并在RBC、Hb、HCT、SI、脾脏指数五项指标上优于OTf-Fe组，差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01），在HCT、MCV两项指标上显著或极显著地优于复合配方2组；并且在除RDW值之外的所有指标上，复合配方1组均达到或接近正常对照组水平。将OTf-Fe按照复合配方1组进行复方，得到的产品补铁效果极显著地优于FeSO4和单独补充OTf-Fe，补充21d后，各项指标达到或接近正常水平。复合配方2组在补铁10d后未显示出明显的优势，其全血各项指标均于FeSO4组无显著差异（P>0.05）。补铁21d后，复合配方2组开始表现出较明显的优势：在Hb、RDW、SF、脾脏指数四个指标上显著优于FeSO4组（P<0.05），并且肝脏颜色较FeSO4组深；与OTf-Fe组相比，其在Hb和脾脏指数上具有显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）的优势；与正常对照组相比，其在RBC、HCT、MCV、RDW值上仍存在显著差异（P<0.05）；此外，复合配方2组在HCT、MCV两个指标上逊于复合配方1组，差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。将OTf-Fe按照复合配方2组进行复方，得到的产品补铁效果优于FeSO4和单独补充OTf-Fe，但与复合配方1组差距明显，不是最佳的产品配方选择。50万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价第四章卵转铁蛋白补铁片剂的研制从市场调研情况来看（见附录-表1），目前我国市面上的补铁产品的制剂类型主要有三种：片剂（随水吞服型）、软胶囊以及口服液，其中片剂与软胶囊所占比例较大。综合考虑市场和可利用设备两方面因素，最终确定以片剂作为卵转铁蛋白补铁产品的制剂类型。在片剂压制方法上，研究者选择了粉末直接压片法。该方法是从上世纪50年代开始，随着新型辅料的出现和压片机性能的不断提高应运而生的，并在数十年的发展中不断为生产企业所接受（McCormickD,2005）。Shangraw等（2005）对美国制药企业的一项调查显示，41.4%的制药企业优先选择粉末直接压片，41.1%的制药企业同时选择粉末直接压片和湿法制粒压片，只有15.5%的企业不提倡粉末直接压片，另只有1.7%的企业从未使用过粉末直接压片。与传统的湿法制粒压片相比，粉末直接压片具有生产成本低、工艺简单的优势，同时又能保证产品的质量。本章将按照第二章通过动物实验优选出来的主料配方，进行卵转铁蛋白补铁片剂的研制。在对市售补铁产品进行充分分析，并阅读大量参考文献的基础上，选择适当辅料，考虑片剂成型性、外观、硬度、崩解时限以及粘冲率等因素，分别进行单因素试验；之后通过正交试验对各辅料添加量进行了优化，最终确定卵转铁蛋白补铁片剂的最优处方，并通过验证性实验对最优处方进行验证。1材料与方法1.1材料1.1.1原料铁结合卵转铁蛋白粉，自制阿胶、大枣、枸杞子，均购自北京同仁堂（武汉）1.1.2试剂富马酸亚铁食品级郑州瑞普生物维生素C食品级郑州瑞普生物微晶纤维素AR国药集团化学试剂有限公司交联聚乙烯吡咯烷酮AR阿拉丁试剂有限公司硬脂酸镁AR国药集团化学试剂有限公司51万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.1.2仪器与设备旋转式压片机ZP-5上海天峰制药设备有限公司片剂四用测定仪SY-3D黄海药检设备有限公司电子天平YP2002上海越科学仪器有限公司筛子40-100目绍兴申光仪器制造有限公司干燥器300mm广州昕迪实验器材有限公司分析天平AR2140奥豪斯国际贸易有限公司1.2片剂压制工艺流程主料粉碎过筛混混压合合片辅料粉碎过筛润滑剂图4-1.卵转铁蛋白铁片剂压制工艺流程Fig4-1.Processflowofpressingovotransferrin-irontablets1.3指标评价或测定方法1.3.1片剂外观评价标准表4-1.片剂外观评价标准Table4-1.Evaluationcriterionoftablets’appearance评价标准得分片剂完整、光洁、色泽均匀、无粘冲现象8-10片剂光洁度、色泽稍差、有轻微粘冲现象5-7片剂破损、光洁度、色泽差、粘冲现象严重1-41.3.2片剂崩解时限测定方法按《中国药典2010》要求，使用片剂四用测定仪测定，测定方法如下：将吊篮通过上端的不锈钢轴悬挂于金属支架上，浸入1000ml烧杯中，并调节吊篮位置使其下降时筛网距烧杯底部25mm，烧杯内盛有温度为37℃±1℃的水，调节水52万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价位高度使吊篮上升时筛网在水面下15mm处。取供试品6片，分别置上述吊篮的玻璃管中，启动仪器进行检查，各片均应在15min内完全崩解。如有1片不能完全崩解，则另取6片复试，均应符合规定。1.3.3片剂硬度测定方法按照制剂学要求，使用片剂四用测定仪进行测定，测定方法如下：将压制好的片剂至于仪器的硬度测试器左侧，调节片剂直径，启动仪器进行测定。该指标应达到4kg以上。1.3.4粘冲率每20片片剂中由于粘冲而导致破损的片剂数。1.3.5正交试验片剂的综合评分片剂的质量好坏主要由其硬度、崩解时限以及粘冲情况决定，因此综合考虑这项指标，采用公式4-1对片剂进行综合评分：（15崩解时限测定值）粘冲率综合评分=硬度（4-1）1010注：其中粘冲率为每20片中因粘冲而导致片剂破损或表面不光洁的数量1.4单因素实验设计1.4.1片剂压制预实验为了判断原料的性质，在进行单因素试验之前，首先将卵转铁蛋白铁粉末、中药粉末与―干黏合剂‖微晶纤维素混合，进行片剂压制预实验。观察片剂的成型性、外观以及粘冲情况，测定产品的硬度和崩解时限，以便为后续实验指引方向。1.4.2微晶纤维素（MCC）粒度对片剂外观的影响将微晶纤维素分别过40目、60目、80目、100目筛，再与主料和其它辅料混合、压片，对所得片剂外观进行评价。其中微晶纤维素添加量为15%，硬脂酸镁添加量为0.5%，交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）添加量为5%。1.4.3硬脂酸镁添加量对片剂粘冲情况的影响将硬脂酸镁分别按0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的量进行添加，与主料和其它辅料混合后压片，对粘冲情况进行评价；此外，由于硬脂酸镁具有疏水性，可能会对片53万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文剂的硬度造成影响，因此同时测定片剂的硬度。其中微晶纤维素添加量为15%，交联聚乙烯吡咯烷酮添加量为5%，微晶纤维素过80目筛。1.4.4微晶纤维素添加量对片剂成型性及硬度的影响将微晶纤维素分别按10%、20%、30%的量进行添加，与主料和其它辅料混合后压片，对片剂成型性、硬度进行评价；考虑微晶纤维素与交联聚乙烯吡咯烷酮有协同崩解作用，故同时测定片剂的崩解时限。其中硬脂酸镁添加量为0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮添加量为5%，微晶纤维素过80目筛。1.4.5交联聚乙烯吡咯烷酮添加量对片剂崩解时限的影响将交联聚乙烯吡咯烷酮分别按1%、3%、5%的量进行添加，与主料和其它辅料混合后压片，测定片剂的崩解时限。其中微晶纤维素添加量为20%，硬脂酸镁添加量为0.7%，微晶纤维素过80目筛。2.结果与分析2.1片剂压制预实验结果通过预实验，发现卵转铁蛋白铁、中药粉末与微晶纤维素混合后所压制出的片剂成型性良好，硬度为4.29kg，崩解时限为25分钟；但其表面存在大量分布不均匀的白斑，可能是由于所使用的微晶纤维素粒度过大，同时存在一定的粘冲现象。综合分析预实验所得到的结果，研究者将后续研究的重点放在改善片剂表面白斑情况和粘冲情况，同时通过添加适量崩解剂改善片剂的崩解时限，以满足《中国药典2010》中对片剂崩解时限的要求（＜15Min）。2.2微晶纤维素粒度对片剂表面白斑情况的影响微晶纤维素粒度对片剂表面白斑的影响见表4-2。表4-2.微晶纤维素粒度对片剂表面白斑情况的影响Table4-2.EffectofparticlesizeofMCContheappearanceoftablets筛子目数片剂表面白斑情况40目表面存在不均匀白斑，且斑点较大60目表面白斑分布趋于均匀，斑点较大80目表面白斑分布均匀，斑点小100目表面白斑分布均匀，斑点小54万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价由表4-2可以看出：当微晶纤维素全部通过80目筛或100目筛时，所得到的片剂表面光滑，白斑分布均匀，斑点小。考虑颗粒粒度太小影响自动进样时的流动性，因此研究者最终选择使用80目筛。2.3硬脂酸镁添加量对片剂粘冲情况的影响硬脂酸镁添加量对片剂粘冲情况及硬度的影响见表4-3。表4-3.硬脂酸镁添加量对片剂粘冲情况的影响Table4-3.Effectofadditiveamountofmagnesiumstearateontablets’stickingsituation硬脂酸镁添加量粘冲情况硬度（kg）0.1%存在粘冲现象，多数片剂不完整4.23±0.1550.3%存在粘冲现象，部分片剂不完整4.19±0.1250.5%粘冲现象改善，部分片剂不完整4.18±0.0960.7%粘冲现象基本消失，片剂完整4.22±0.110由表4-3可以看出：随着硬脂酸镁添加量的增加，片剂的粘冲现象逐步改善，添加量为0.7%时，片剂的粘冲现象基本消失；硬度随硬脂酸镁用量的增加无显著变化（P>0.05），在添加量为0.7%时，片剂硬度可达到4.22±0.110kg，符合制剂学上对片剂硬度的要求。因此，研究者最终选择0.7%做为硬脂酸镁的添加量。2.4微晶纤维素添加量对片剂成型及指标的影响表4-4.微晶纤维素添加量对片剂成型及指标的影响Table4-4.EffectoftheadditiveamountofMCConformabilityandindicatorsoftablets添加量成型性崩解时限（min）硬度（kg）10%片剂完整，片面光洁153.83±0.11520%片剂完整，片面光洁124.51±0.09230%片剂完整，片面光洁104.71±0.139微晶纤维素添加量对片剂成型及指标的影响见表4-4。由表中可知微晶纤维素的3种添加量均能得到成型性和外观良好的片剂，但当添加量为10%时，片剂的崩解时限处于临界值（15min），同时硬度为3.83±0.115kg，未达到《中国药典》对片剂硬度的要求；而当其使用量增加到20%时，崩解时限和硬度均达到相关要求，其硬度与添加量为10%时差异显著（P<0.05）；当其使用量继续增加至30%时，崩解时限和硬度进一步改善，但硬度与添加剂量为20%时比较，差异不显著（P>0.05）；此外，微晶纤维素作为一种稀释剂，其用量需要考虑两个方面，一方面是其成型性和外观，55万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文另一方面则是其与主料的比例，在确保成型性和外观的前提下，应尽量减少稀释剂的用量，以提高主料的比例。因此，综合考虑上述因素研究者选取20%作为微晶纤维素的添加量。2.5交联聚乙烯吡咯烷酮添加量对片剂崩解时限的影响只考虑交联聚乙烯吡咯烷酮对片剂崩解时限的影响，结果见表4-5。表4-5.交联聚乙烯吡咯烷酮对片剂崩解时限的影响Table4-5.EffectofPVPPonthedisintegrationtimeoftabletsPVPP用量崩解时限（min）1%203%155%12由上表可知：随着PVPP用量的增加，崩解时限逐渐降低，当PVPP添加量达到3%时，崩解时限达到15分钟，为《中国药典2010》要求的临界值，进一步增加其用量达到5%时，崩解时限达到12分钟，符合―药典‖的要求，片剂崩解效果好。因此，研究者最终选择PVPP的添加量为5%。2.6正交实验设计及结果2.6.1正交实验设计为了进一步考察3种辅料之间的相互作用，选出最佳辅料配方，研究者在单因素实验的基础上进行了正交实验设计。以微晶纤维素、硬脂酸镁、交联聚乙烯吡咯3烷酮三种辅料的添加量作为因素，每个因素分别选取3个水平，按L9（3）因素水平表设计正交实验，因素水平安排见表4-6。表4-6.因素水平安排表Table4-6.Scheduleoffactorsandlevels因素水平微晶纤维素（A）硬脂酸镁（B）PVPP（C）115%0.5%3%220%0.7%4%325%0.9%5%56万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价2.6.2正交实验结果正交实验结果见表4-7。表4-7.正交实验结果Table4-7.Resultsoforthogonalexperiment因素硬度崩解时限粘冲率综合评分ABC试验号11114.231614.0321224.151404.2531334.081304.2842124.521314.6252234.501204.8062314.471504.4773134.751124.9583214.681504.6893324.691304.89K14.1874.5334.393K24.6304.5774.587K34.8404.5474.677R0.6530.0440.284根据极差分析结果可以看出：3个因素对片剂质量的影响不尽相同，具体来说是微晶纤维素＞交联聚乙烯吡咯烷酮＞硬脂酸镁，微晶纤维素对片剂质量的影响最大，这是由于微晶纤维素在很大程度上决定了片剂的硬度，同时它还与PVPP存在协同作用，因而对崩解时限也具有一定的影响；硬脂酸镁的影响最小说明粘冲不是卵转铁蛋白铁片剂的主要制约因素，通过添加适量润滑剂和选用状态更好的压片机可以予以避免。从表4-7可以看到第九组和第七组的综合评分是最高的，这主要是由于这两组中的微晶纤维素添加量均为第三水平（25%），提高了片剂的硬度，但由于其辅料用量较大，缩小了载药空间，同时也提高了生产成本；而第五组产品，虽然综合评分略低于第九组和第七组，但其微晶纤维素使用量为20%，且硬度、崩解时限都达到相关要求。因此，综合考虑原料成本、辅料与主料配比（应尽可能提高主料占比）等因素，研究者选定第五组配方作为卵转铁蛋白铁片剂的最佳辅料配方，即微晶纤维素20%，硬脂酸镁0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮5%。57万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文2.7验证性实验结果通过正交实验最终确定的最佳片剂辅料配方为：微晶纤维素20%，硬脂酸镁0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮5%。为了对此结果做进一步确认，确保该配方的稳定性和可重复性，研究者进行了验证性实验，其结果表4-8所示：表4-8.验证性实验结果Table4-8.Resultsofreplicationexperiment组别硬度(kg)崩解时限(min)粘冲率(片)14.50±0.09012024.48±0.10011034.51±0.131120由表4-8可以看出，3组验证性实验结果存在小幅波动，但基本稳定，各组硬度、崩解时限、粘冲率均差异不显著（P>0.05），与正交实验的结果相似，表明正交实验所得到的结果稳定性和可重复性良好。2.8操作关键点控制2.8.1原辅料的保存由于卵转铁蛋白铁粉末很容易吸潮，因此需将其过80目筛后，放入密封袋中，添加适量干燥剂（如硅胶），于室温下保存；其它原辅料均为购买，开封之后也应按照卵转铁蛋白铁粉末的要求，密封保存。若物料吸潮，则容易在压片过程中产生粘冲现象，因此一定要严格保证原辅料的干燥。2.8.2物料混合混合是压片之前最重要的步骤，物料是否混合充分决定了所压制的片剂中原辅料是否分布均匀，直接影响片剂的质量和效果，因此在实际生产中应采用卧式螺带混合机进行混合，确保物料混合充分、均匀。2.8.3片剂压制在压片过程中，最重要的是把握好压片机的性能，寻找到与原料相适应的参数。研究者所使用的压片机是ZP-5旋转式压片机，共5孔冲模，旋转速度控制在10r/min左右，不宜过快，以确保自动进样器在每孔冲模中填入等量、充足的物料。此外，环境的相对湿度对压片也会产生影响，若过大则容易导致物料在压片过程中吸潮。58万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价2.9卵转铁蛋白铁片剂成品展示图4-2.卵转铁蛋白铁片剂成品Fig4-2.Productofovotransferrin-irontablets3.小结与讨论通过片剂压制预实验，研究者发现只将卵转铁蛋白铁、中药粉末与微晶纤维素混合压制出来的片剂成型性良好，硬度和崩解时限分别为4.29kg和25分钟（《中国药典2010》要求达到15分钟以下）；同时研究者发现，预实验压制出来的片剂表面存在大量分布不均匀的白斑，并且压制过程中存在一定的粘冲现象；其中白斑的产生很可能是由于微晶纤维素粒度过大而导致的。因此，研究者将重点放在改善片剂外观、消除粘冲现象、缩短片剂的崩解时限上。在预实验的基础上，研究者首先考察了微晶纤维素粒度对片剂表面白斑的影响，结果发现当微晶纤维素的粒度为80目或者100目时，片剂表面不存在不均匀的大面积白斑，考虑原料粒度太小会影响自动进样时的流动性，影响片剂成型，因此研究者最终选择使用80目筛。随后通过对硬脂酸镁添加量的考察，研究者发现随着其添加量的逐步增加，粘冲现象得到逐步的改善，当添加量达到0.7%时，片剂的粘冲现象基本消失，且片剂硬度可达到4.22±0.110kg，符合制剂学相关要求，因此研究者最终选择0.7%作为硬脂酸镁的添加量。接下来研究者考察了稀释剂微晶纤维素的添加量对片剂成型性、硬度及崩解时限的影响，结果显示10%、20%、30%的添加量均可获得完整、光洁的片剂，但添59万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文加量为10%时，片剂的硬度不达标，同时崩解时限处于临界值（15min），而添加量为30%时，虽然各项指标均为最优，但其用量太大。因此，为减少稀释剂的用量、节省成本，同时提高主料的占比，研究者最终选择20%作为微晶纤维素的添加量。最后研究者着力于缩短片剂的崩解时限，以达到相关要求。这里主要考察了崩解剂交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）用量对崩解时限的影响。结果发现当其添加量达到5%时，片剂的崩解效果理想。在单因素实验的基础上，研究者进行了正交实验设计。以三种辅料为因素，其3添加量为水平，设计了L9（3）正交实验。综合考虑原料成本、辅料与主料配比等因素，研究者最后选定第五组作为卵转铁蛋白铁片剂的最佳辅料配方，即微晶纤维素20%，硬脂酸镁0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮5%。最后，为了确保最终确定的辅料配方的稳定性和可重复性，研究者共实施了3组验证性实验，其结果差异不显著（P>0.05），并与正交实验结果相仿，表明该配方稳定性和可重复性良好。本章通过片剂压制预实验、单因素实验、正交实验和验证性实验，确定了卵转铁蛋白铁片剂的最佳辅料配方为：微晶纤维素20%，硬脂酸镁0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮5%。综合第二章确定的最佳主料配方，卵转铁蛋白补铁产品的最优配方为：卵转铁蛋白铁0.5g、富马酸亚铁1.63mg、抗坏血酸12.58mg、阿胶0.1g、大枣与枸杞子水提物0.1g（生药比5:4）、微晶纤维素0.1g、硬脂酸镁3.5mg、交联聚乙烯吡咯烷酮25mg。60万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价第五章卵转铁蛋白铁片剂生产经济技术分析近年来我国功能食品（保健品）市场迅速增长，消费者对功能食品的需求量日益增加，表5-1展现了2007和2012年世界上各大主要经济体功能食品的销售情况，我国5年内功能食品销售增长幅度达81.22%（尤新,2009），居各大经济体之首，由此可见我国功能性食品市场的巨大潜力。在这种背景下，开发新型功能性食品能够更好地满足消费者的诉求，具有广阔的市场前景。根据市场调研（见附录-表1），目前我国市面上存在的补铁剂以有机酸铁（富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁等）和血红素铁（动物血、卟啉铁等）为主，未见以卵转铁蛋白为载体的补铁剂；而卵转铁蛋白补铁剂除能提供补铁功效外，还兼具调节胃肠道微生物菌群、抗氧化、降血压等功效，并且具有低毒副作用的特点，是一种极具潜力的新型功能性食品。在对卵转铁蛋白铁剂的补铁功效、处方组成等进行研究之后，本章主要针对生产环节，对卵转铁蛋白铁片剂的生产进行设备能力估算和选型，并在此基础上进行经济技术分析，以了解卵转铁蛋白铁片剂生产的投资、收益、风险、成本回收期等，为后续工业化生产提供参考依据。在设备选型方面力求保证生产效率和产品质量，生产效率以满足预设产能为标准，产品质量则应保证满足《中国药典2010》的相关要求。表5-1.世界主要经济体2007和2012年功能食品销售增长情况（百万美元）Table5-1.Salesstatusoffunctionalfoodsinmaineconomicentitiesduringtheyearof2007and2012(millionUSD)地区2007年2012年增长率美国476006843643.77%西欧424935294924.61%中东欧1234198761.02%日本163011811311.12%中国107511948381.22%61万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文1.卵转铁蛋白铁片剂工厂生产流程卵转铁蛋白铁片剂工厂生产流程见图5-1。原料验收、入库原料预处理配料粉碎、筛分成品入库灌装片剂压制混匀图5-1.卵转铁蛋白铁片剂工厂生产流程示意图Fig5-1.Schematicdiagramofovotransferrin-irontabletsproductioninfactory2.卵转铁蛋白铁片剂生产线主要设备及选型2.1生产线产能估算根据某蛋品深加工企业每年蛋制品加工处理量，预设生产线产能为年出产卵转铁蛋白铁片剂8000万片，以每年273个工作日计算，每天需要生产29.31万片，按照每天生产8小时计算，每小时需生产片剂3.67万片，需处理原辅料30.47kg，需灌装612瓶（60片/瓶）。以上述产能为依据，选择相应生产设备。2.2主要设备选型根据上述生产线产能设计，需要处理量在35kg/h以上的粉碎机、筛分机、卧式螺带混合机各一台；产能在4万片/h左右的压片机一台；处理量在700瓶/h以上的包装生产线一条。卵转铁蛋白铁片剂生产线主要设备及型号见表5-2。表5-2.卵转铁蛋白铁片剂生产线主要设备Table5-2.Majorequipmentsofovotransferrintabletsproductionline设备名称设备型号功率（kw）产能数量卧式螺带混合机CH-2004/0.5540kg/批1粉碎机GFSJ-8A410-100kg/h1筛分机ZS-3500.5560-500kg/h1压片机ZPW-172.24万片/h1全自动数粒包装机THSL-604.51200-3000瓶/h162万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价该生产线的设备总功率为15.8kw，产能设计为每个工作日（按8小时计算）生产量：0.5万瓶（60片/瓶）。3.卵转铁蛋白铁片剂生产经济技术分析根据卵转铁蛋白铁的原料来源和提取工艺，将卵转铁蛋白铁粉的价格定为500,000元/吨。3.1项目总投资估算本项目的经济技术分析以具有相应投资和生产能力的大中型蛋品加工企业或保健品开发企业为背景，因此在项目建设投资方面不考虑土地购置费、运输设备费等。3.1.1建筑工程费厂房设计面积为25000mm×30000mm，主要划分为原料库、辅料室、原辅料加工车间、压片和灌装车间、成品库。建筑工程费采用单位建筑工程投资估算法，以单位建筑工程量投资乘以建筑工程总量对建筑工程费用进行计算。22建筑工程费=25×30m×500元/m=37.5万元3.1.2装修工程费厂房的装修工程费用以建筑面积乘以单位装修造价进行计算。22装修工程费=25×30m×60元/m=4.5万元3.1.3设备购置费用表5-3.卵转铁蛋白铁片剂生产线主要生产设备购置费用Table5-3.Purchasecostofthemajorequipmentsofovotransferrintabletsproductionline设备名称设备型号数量价格（万元）卧式螺带混合机LHY-0.2511.2粉碎机GFSJ-8A12.6筛分机ZS-35010.88压片机ZPW-1715.2全自动数粒包装机THSL-60125.00总计——34.883.1.4设备维护及管理费用按照设备购置总金额×5%计算，预计为1.75万元。63万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文3.1.5技术服务费技术服务费用为30万元。3.1.6低值易耗品购置费低值易耗品购置费为5万元。3.1.7不可预见性开支不可预见性开支又称基本预备费，主要为解决在施工过程中，经上级批准的设计变更和国家政策性调整做增加的投资以及为解决意外事故而采取措施所增加的工程项目和费用。不可预见性开支按照公式5-1进行计算，基本预备费率按照机械工程项目计算（10%），估算额为8.37万元。不可预见性开支=（工程费用+工程建设其它费用）×基本预备费率（5-1）3.1.8流动资金按照工程总投资的30%计算，估算额为36.6万元。3.1.9工程总投资汇总本项目工程总投资汇总见表5-4。表5-4.卵转铁蛋白铁片剂生产项目总投资估算汇总（万元）Table5-4.Collectionofestimatedgrossinvestmentsofovotransferrintabletsproductionproject费用分类费用名工程费用设备费用预备费用其它费用流动资金合计建筑工程费37.50装修工程费4.50设备购置费34.88设备维护及管理费1.75不可预见性开支8.37低值易耗品购置费5.00技术服务费30.00项目建设投资额42.0036.638.3735.00122.00流动资金36.636.6总投资额42.0036.638.3735.0036.6158.664万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价3.2项目成本费用估算3.2.1原辅料成本估算原料主要包括卵转铁蛋白铁粉、富马酸亚铁粉、大枣、阿胶、枸杞子、维生素C，辅料主要包括微晶纤维素、硬脂酸镁、交联聚乙烯吡咯烷酮。原辅料具体用量及成本见表5-5。表5-5.原辅料成本估算Table5-5.Costestimationofrawmaterialsandauxiliarymaterials原辅料名称年用量（t）单位成本（元/t）总成本（万元）卵转铁蛋白铁粉40500,0002000.000富马酸亚铁0.15150000.225维生素C1.1290003.190大枣184000072.000枸杞子7.54500033.750阿胶8130000104.000交联聚乙烯吡咯烷酮219000038.000微晶纤维素84800038.400硬脂酸镁0.3165000.495合计——2290.063.2.2水电费用估算主要生产设备功率汇总见表5-6，水电费用估算见表5-7。表5-6.生产设备功率汇总Table5-6.Collectionofproductionequipments’power设备名称单机功率（kw）工作时间（h/天）设备数量总功率（kw）卧式螺带混合机4.55814.55粉碎机4814筛分机0.55810.55压片机2.2812.2全自动数粒包装机4.5814.5其它设备208—20合计———35.865万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文表5-7.水电费用估算Table5-7.Estimationofthecostofwaterandelectricity费用类别单价用量估算费用估算（万元）320000m33.3用水费用1.65元/m用电费用0.96元/千瓦时80000千瓦时7.7合计—11如表5-6所示，卵转铁蛋白铁片剂生产线主要生产设备总功率为35.8kw，即每小时用电35.8千瓦时（度），按每天工作8小时，全年工作273天计算，全年用电量约为8万千瓦时，按照湖北省一般工业用电价格0.96元/千瓦时计算，则全年电费3成本约为7.7万元。工业用水价格按1.65元/m计算，由于该生产线并不需要用水，3故用水主要为生活用水、厂房和仪器清洗用水等，估计用量为20000m，全年用水费用大约为3.3万元。3.3.3包装材料费用估算包装材料主要包括包装瓶和标签纸，其费用估算见表5-8。表5-8.包装材料费用估算Table5-8.Costestimationofpackagingmaterials包装材料单价规格用量估算费用估算（万元）150ml137万个89.05包装瓶0.65元/个标签纸0.02元/PCS2-35cm137万张2.74合计———91.793.3.4员工工资及福利费用估算员工工资费用估算见表5-9。员工福利依据相关规定，按照工资的14%进行估算，年费用为4.2万元。因此全年员工工资及福利费用大约为34.2万元。表5-9.员工工资费用估算Table5-9.Costestimationofemployeewages岗位人数单人月工资（元）合计年工资（万元）原料验收入库215003.6压片前处理320007.2片剂压制125003.0产品包装225006.066万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价成品库管理115001.8质检员130003.6车间主任140004.8合计11—30.03.3.5固定资产折旧费用估算固定资产折旧费采用平均年限法进行估算，设备残值按照原值5%计算，年均折旧值按照公式5-2计算，依据国家相关规定，固定资产中建筑物折旧年限以20年计，生产设备折旧年限以10年计。经计算，固定资产年均折旧费用为5.309万元，具体见表5-10。固定资产原值-残值年均折旧值=（5-2）折旧年限表5-10.固定资产折旧费用估算Table5-10.Depreciationexpenseestimationoffixedassets固定资产类别折旧年限原值（万元）残值（万元）年均折旧值（万元）建筑物20年42.0002.1001.995生产设备10年34.8801.7443.314合计———5.3093.3.6项目管理费用估算年项目管理费用以年销售收入的2%进行估算，约为213万元。3.3.7销售费用估算年销售费用按照年销售收入的10%进行估算，约为1065万元。3.3.8年成本费用汇总年成本费用情况见表5-11。表5-11.年成本费用估算汇总Table5-11.Collectionofestimationofannualcost项目费用数额（万元）原辅料成本2290.060水电费11.00067万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文包材费91.790工资及福利费34.200折旧费5.309管理费用213.000销售费用1065.000合计3710.359固定成本*252.509变动成本**3457.85*固定成本=工资及福利费+折旧费+管理费用**变动成本=总成本-固定成本盈亏平衡点=固定成本/（1－变动成本/产品销售收入）3.3投资回收效益分析根据市售主要补铁产品价格，结合卵转铁蛋白铁片剂的实际情况，产品销售单价暂定为78元/瓶，每瓶含卵转铁蛋白铁片60片；按照预设产能，年产卵转铁蛋白铁片剂136.5万瓶，实现销售收入10647万元。投资回收效益分析具体见表4-12。表5-12.投资回收效益分析Table5-12.Investmentrecoveryandprofitanalysis项目金额（万元）总投资158.600年成本3710.359年销售收入10647.000年毛利6936.641企业所得税（25%）1734.160增值税（17%）*1179.229销售税金**117.923年净利润3905.329投资回收期***0.541年*增值税按照一般纳税人计算**销售税金按照增值税的10%计算***投资回收期=总投资/年净利润+建设期如表5-12所示，卵转铁蛋白铁片剂项目预计可实现毛利润6936.641万元，扣除企业所得税、增值税和销售税金后，可实现净利润3905.329万元；由于片剂生产项68万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价目投资较小，故其投资回收期较短，在顺利实现销售收入的前提下，投资回收期大约为半年。3.4风险分析3.4.1盈亏平衡点盈亏平衡点（BreakEvenPoint）又称零利润点，是指销售收入与全部成本相等时的销售额（或销售量）。当销售额高于盈亏平衡点时企业盈利，低于时则亏损。盈亏平衡点按照公式5-3进行计算，结果为374.1万元，即当实现销售额374.1万元时，企业可保证不亏损。固定成本盈亏平衡点（销售额）（5-3）1-变动成本/产品销售收入3.4.2经营安全率经营安全率是指企业经营规模（以销售额表示）超过盈亏平衡点的程度，是一个相对指标，其大小反映企业发生亏损的可能性。其计算按照公式5-4进行，结果显示经营安全率r为96.49%；这表明若能顺利实现预设销售额，本项目发生亏损的可能性极小，风险较低。RR0r（5-4）R式中：r为经营安全率R0为盈亏平衡点的销售收入R为计划实现的销售收入4.小结本章对卵转铁蛋白铁片剂生产项目的投资、成本、利润进行了估算，并对其投资回收效益、风险等进行了分析。结果显示卵转铁蛋白铁片剂的投资额为158.6万元，年生产成本为3710.359万元，年销售收入为10647万元，年毛利润6936.641万元，每年可实现利税约3031.312万元，可实现年净利润约3905.329万元，投资回收期为半年左右，盈亏平衡点销售额为374.1万元，经营安全率达96.49%。由此可见，在顺利实现预设产值和销售量的前体下，卵转铁蛋白铁片剂生产项目收益较大，风险可控，是一个具备较高投资潜力的生产项目。69万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文第六章结论1.结论（1）采用乙醇一次提取法提取Holo-卵转铁蛋白原料，采用SDS-PAGE、AAS等方法对其进行鉴定，结果表明所提得的5批Holo-卵转铁蛋白中主要杂蛋白为卵类黏蛋白，Holo-卵转铁蛋白纯度约为54.9±0.4%，得率约为91.24±1.05%，铁含量约为0.965±0.034mg/g蛋白质，各组间铁含量差异不显著（P>0.05），表明所采用的提取方法所得Holo-卵转铁蛋白中铁含量较稳定。同时对提取所得Holo-卵转铁蛋白在SGF中的消化性能进行了评价，结果表明Holo-卵转铁蛋白在SGF中于5s内被分解成15kd以下的肽段，消化性能极好；随后，又采用磺基水杨酸法对卵转铁蛋白在3+3+SGF中的Fe释放情况进行了检测，结果表明Fe在2min的时间内基本释放完全。（2）通过动物实验对卵转铁蛋白铁剂的补铁功效进行了评价，结果表明卵转铁蛋白铁剂对IDA模型大鼠具有显著的恢复作用，随着补充时间的延长，各项指标逐步改善；补铁前10d，全血各项指标改善幅度较大，之后放缓，在补铁21d后，OTf-Fe组、复合配方1组和复合配方2组均能够使IDA大鼠的全血、血清、脏器的各项指标得到极显著的恢复。与FeSO4组相比较，在补铁10d时，复合配方1组在多项指标上均显著优于FeSO4组（P<0.05）；而OTf-Fe组、复合配方2组则与之差异不显著（P>0.05）；补铁21d后，复合配方1组的优势更加凸显，其全血各项、SI、SF、肝脏指数、肝脏色泽均显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）地优于FeSO4组；复合配方2组也开始体现出一定优势，其在Hb、RDW、SF、脾脏指数四个指标上显著优于FeSO4组（P<0.05），并且肝脏颜色较FeSO4组深；而OTf-Fe组各项指标与FeSO4组无显著性差异（P>0.05），但在SF、RDW和肝脏颜色上较之更优。与正常对照组相比，在补铁10d时，各组指标均与之存在显著或极显著差异；补铁21d后，复合配方1组除RDW之外的各项指标均与之无显著差异（P>0.05），而OTf-Fe组和复合配方2组仍有多项指标与之差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。复合配方1组与OTf-Fe、复合配方2组相比较，在多项指标上具有显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）的优势；复合配方2组与OTf-Fe组相比较，在补铁21d后，在Hb和肝脏指数上具有显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）的优势。（3）在预实验的基础上，通过单因素实验分别考察了微晶纤维素粒度、硬脂酸镁添加量、微晶纤维素添加量以及交联聚乙烯吡咯烷酮添加量对片剂成型性、硬度、70万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价崩解时限、粘冲情况等的影响；随后通过正交实验确定了卵转铁蛋白铁片剂的最优辅料处方，并通过验证性实验验证了处方的稳定性；最终确定了卵转铁蛋白铁片剂的最优处方为：微晶纤维素20%，硬脂酸镁0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮5%。（4）对卵转铁蛋白铁片剂生产项目的投资、成本、利润进行了估算，并对其投资回收效益、风险等进行了分析。结果显示卵转铁蛋白铁片剂的投资额为158.6万元，年生产成本为3710.359万元，年销售收入为10647万元，年毛利润6936.641万元，每年可实现利税约3031.312万元，可实现年净利润约3905.329万元，投资回收期为半年左右，盈亏平衡点销售额为374.1万元，经营安全率达96.49%。在顺利实现预设产值和销售量的前体下，卵转铁蛋白铁片剂生产项目收益较大，风险可控，是一个具备较高投资潜力的生产项目。2.本研究的创新点（1）评价了Holo-卵转铁蛋白及其配方产品的补铁功效，证明了单独补充Holo-卵转铁蛋白的补铁效果略优于FeSO4，而其配方产品中以复合配方1补铁效果最佳，可作为卵转铁蛋白补铁产品的主料配方。（2）研究了卵转铁蛋白铁片剂的压制工艺，确定了其最优辅料处方：微晶纤维素20%，硬脂酸镁0.7%，交联聚乙烯吡咯烷酮5%（3）开发了一种新型蛋白质螯合铁补铁剂——卵转铁蛋白铁的最优配方：卵转铁蛋白铁0.5g、富马酸亚铁1.63mg、抗坏血酸12.58mg、阿胶0.1g、大枣与枸杞子水提物0.1g（生药比5:4）、微晶纤维素0.1g、硬脂酸镁3.5mg、交联聚乙烯吡咯烷酮25mg。71万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文参考文献1.李晓明,陈新贵,韩丽英等.乳酸亚铁治疗缺铁性贫血的临床研究.泸州医学院学报,2002,25(6):508-509.2.窦焕福.琥珀酸亚铁治疗缺铁性贫血疗效观察.北京医科大学学报,1991,23(1):48-50.3.张晓鸣,黄玲,朱建平,姚惠源.甘氨酸螯合铁对大鼠补铁效果的评价.食品与生物技术学报,2008,27（01）:20-25.4.李璐,周帆,侯健.静脉用右旋糖酐铁对治疗缺铁性贫血的疗效观察.临床血液学杂志，2010,23（7）:438-439.5.王宝琴,徐泽平,刘雪红.多糖铁复合物的研究进展.安徽农业科学,2007,35（23）：7044-7046.6.王花,樊君.大枣多糖铁（III）复合物的合成研究（D）.西安.西北大学.2009.7.刘娅,韩新年.天然补铁剂—血红素铁的研究进展.中国食品添加剂,2005,（4）：5-8.8.王茵，周淡宜，朱染枫等.血红素形式铁和乳酸亚铁改善营养性贫血的实验观察.毒理学杂志,2007,21（1）:46—48.9.袁小军，马美湖，黄群，等．两步超滤法分离鸡蛋清中卵转铁蛋白的研究.食品与机械，2011，27(2):125～128．10.一种从鸡蛋清中提取卵转铁蛋白的方法.中华人民共和国.C07K14/79(2006.01)I.CN102796193A.2012.11.2811.宗艳,赵春贵,黄登宇.卵铁蛋白铁生物补铁剂对贫血模型小鼠的影响.药物生物技术.2007,14(3):212-214.12.杜华英,徐明生,蒋艳等.卵转铁蛋白铁制剂对缺铁性贫血小鼠的影响.营养学报,2010,32(04):354-357.13.展筱林，王凤山，王京端等.缺铁性贫血治疗药物研究进展.齐鲁医学杂志.2008,23(5):467-470.14.尤新.类胡萝卜素功能和国际发展动向.中国食品质量报.2009.12.5（6）15.袁小军，马美湖，黄群等．两步超滤法分离鸡蛋清中卵转铁蛋白的研究.食品与机械，2011，27(2):125-128.72万方数据 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华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文oferrinusingDEAEAffi-GelBlue.Int.Biochem,1991,23:609–616.80.AwadeAC,MoreauS,MolleD,BruléG,andMauboisJL,Two-stepchromatographicprocedureforthepurificationofheneggwhiteOTfmucin,lysozyme,ovotransferrinandovalbuminandcharacterizationofpurifiedproteins.JChromatogrA,1994,677:279–288.81.C.Guérin-Dubiard,M.Pasco,A.Hietanen,A.Q.delBosque,F.Nau,T.Croguennec.Heneggwhitefractionationbyion-exchangechromatographyJournalofChromatography.A,2005,1090:58–67.82.Ahlborn,G.J.,D.A.Clare,B.W.Sheldon,andR.W.Kelly.Identificationofeggshellmembraneproteinsandpurificationofovotransferrinandβ-NAGasefromheneggwhite.ProteinJ,2006,25:71–81.83.D.A.Omana,J.P.WuAnewmethodofseparatingOTfmucinfromeggwhite.Agr.FoodChem,2009,57:3596–3603.84.Guerin,C.,andG.Brule.Separationofthreeproteinsfromeggwhite.Sci.Aliments,1992,112:705.85.Ko,K.Y.andAhn,D.U.Aneconomicandsimplepurificationprocedureforthelarge-scaleproductionofovotransferrinfromeggwhite.PoultrySci,2008,87:1441-1450.86.FrancoPazzucconiet.al.Iron-ovotransferrinpreparationdoesnotinterferewithciprofloxacinabsorption,1996,59:418-422.87.Ibrahim,H.R.,Y.Sugmito,andT.Akoi.2000.Ovotransferrinantimicrobialpeptide(OTAP-92)killsbacteriathroughamembranedamagemechanism.Boichim.Biophys.Acta,2000,1523:196–205.88.Moon,S.H.,J.H.Lee,Y.J.Lee,K.H.Chang,J.Y.Paik,D.U.Ahn,andH.D.Paik.Screeningforcytotoxicactivityofovotransferrinanditsenzymehydrolysates.Poult.Sci,2013.92:424–434.89.Wu,J.,andA.Acero-Lopez.2012.Ovotransferrin:Structure,bioactivitiesandpreparation.FoodRes.Int,2012,46:480–487.90.KaustavMajumder,SubhadeepChakrabarti,JudeS.Morton,etal.Egg-DerivedTri-PeptideIRWExertsAntihypertensiveEffectsinSpontaneouslyHypertensiveRats.PLOSONE.ArticleIDe82829.2013,8(11).91.Istva´nSiro,EmeseKa´polna,Bea´taKa´polna,etal.Functionalfood.Productdevelopment,marketingandconsumeracceptance—Areview.Appetite,2008,78万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价51:456-467.92.Warner,R.C.,andI.Weber.Thepreparationofcrystallineovotransferrin.Biol.Chem,1951,191:173–180.93.Guerin,C.,andG.Brule.Separationofthreeproteinsfromeggwhite.Sci.Aliments,1992,112:705–720.94.Ko,K.Y.andAhn,D.U.Aneconomicandsimplepurificationprocedureforthelarge-scaleproductionofovotransferrinfromeggwhite.PoultrySci,2008,87:1441-1450.95.MedinaI,TomboI,Satué-GraciaMT,GermanJB,FrankelEN.Effectsofnaturalphenoliccompoundsontheantioxidantactivityoflactoferrininliposomesandoil-in-wateremulsions.Journalofagriculturalandfoodchemistry,2002,50:2392-2399.96.McCormickD.Evolutionsindirectcompression.PharmTechnol,2005,29(4):52-58.97.GohelMC.Areviewofco-processeddirectlycompressibleexcipients.JPharmPharmSci,2005,8(1):76-93.79万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文附录表1.常见市售补铁产品配方名称剂型主料辅料规格厂商辅助功能产品批号美澳健片剂氯化血红素铁、Vc、酪葡萄糖粉、大豆浓缩粉、0.6g×60片/瓶广东长兴科技保健品有美容养颜国食健字G20041357血红素蛋白钙肽糊精、葡萄糖浆限公司补铁片体恒健片剂富锌蛋白粉、阿胶、乳白砂糖、淀粉、羟丙基甲0.3g×100片/山东新稀宝股份有限公内分泌调节国食健字G20050838牌铁之酸亚铁基纤维素瓶司缘片海王血软胶囊血红素铁，富马酸亚铁，食用明胶、食用甘油、食0.25g×60粒/杭州海王生物工程有限美容养颜浙卫食证字[2008]红素铁维生素B1、B2、B6、用植物油瓶公司第330110100847（卟啉B12，泛酸，叶酸，烟酰铁）软胶胺囊红桃K片剂葡萄糖酸亚铁、叶酸山梨糖醇、葡萄糖等0.5g×60片/瓶武汉红桃开药业股份有孕产妇营养国食健字G20100388维妥立限公司牌叶酸铁片泰尔血片剂乳酸亚铁（9.75mgFe/玉米淀粉0.5g×100片/湖南泰尔制药有限公司—国食健字G20050032素铁质片）、维生素C（32mg/瓶维C叶片）、叶酸（250μg/片）酸片红桃K片剂卟啉铁（2.53mgFe/片）、—1.1g×12片/盒武汉红桃开药业股份有更年期健康（鄂）卫食证字养血活枸杞、大枣、山楂、硫限公司（2007）第力片酸锌（2.2-3.85mgZn/片）429000-000009号天狮血胶囊猪血（1-1.4mgFe/粒）、明胶、苋菜红0.2g×120粒/天津天狮生物工程有限孕产妇营养卫食健字（1998）之铁胶大枣、黑米瓶公司第639号囊80万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价Nature片剂硫酸亚铁（65mgFe/片）纤维素胶、碳酸钙、交联0.54g×300片/NatureMadeNutritionalMade羧甲基纤维素钠、羟丙甲瓶ProductsIron纤维素、硬脂酸镁、聚乙二醇Ultra片剂硫酸亚铁（65mgFe/片）乳糖、山梨糖醇、纤维素、100片/瓶GNC（健安喜）孕产妇营养—Iron65硬脂酸镁、植物乙酰甘油、棕榈蜡、二氧化钛、聚乙二醇、叶绿素、聚山梨醇酯80、黄原胶、交联聚乙烯吡咯烷酮康富来口服液卟啉铁（29.3mg纯化水76ml/瓶广东康富来药业有限公美容养颜卫食健字（2000）血尔口Fe/100g）、鲜鸡、当归、司第0498号服液黄芪汤臣倍片剂富马酸亚铁（16mgFe/微晶纤维素、预胶化淀粉、0.51g×60片/广东汤臣倍健生物科技美容养颜国食健字G20100800健叶酸片）、叶酸（217μg/片）糊精、聚乙烯吡咯烷酮、瓶股份有限公司亚铁片硬脂酸镁、聚丙烯酸树脂（IV号）、丙甲纤维素（E-30）、聚乙二醇4000澳天力软胶囊氯化高铁血红素（4mg大豆油、大豆磷脂、蜂蜡、0.5g×100粒/广东美丽康保健品有限—国食健字G20120093牌氯化Fe/粒）明胶、甘油、二氧化钛、瓶公司高铁血水、焦糖色、辣椒红红素胶囊安利纽片剂富马酸亚铁、葡萄糖酸牡蛎壳粉、麦芽糊精、微120片/瓶安利美国——崔莱铁亚铁（10mgFe/片）叶酸晶纤维素、纤维素胶、阿质叶酸（133μg拉伯胶、羟丙甲纤维素、片/片）、脱水菠菜二氧化硅、硬脂酸镁、玉米淀粉、磷酸二钙、甘油DHC红胶囊血红素铁（6mgFe/粒）、—0.35g×120粒/DHC——嫩铁素叶酸（70μg/粒）、维生素瓶B12（1μg/粒）81万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文三精牌口服液葡萄糖酸亚铁（3.6mg/白砂糖、可可香精10ml/支哈药集团三精制药股份—卫食健字（2006）第血宜生支）、叶酸、红花生衣、有限公司230000-070010号口服液维生素B12康比特胶囊猪肝粉、EDTA铁钠—0.44g×100粒/北京康比特体育科技股调节血糖卫食健字（2003）第牌比特(9.74mgFe/片)、三七粉、瓶份有限公司0434号铁胶囊乳铁蛋白、维生素C、维生素B6(2.2mg/片)、叶酸（193μg/片）、维生素B12、硫酸铜纽斯葆软胶囊富马酸亚铁（10mg/粒）、—450mg×60粒/美国纽斯葆国际集团有—国食健字G20080188天然维维生素E（48mg/粒）瓶限公司生素e铁软胶囊永宁牌片剂琥珀酸亚铁蔗糖、淀粉、羟丙甲纤维素、0.1g琥珀酸金陵药业股份有限公司—国药准字H10930005琥珀酸聚山梨酯80、羧甲基淀粉亚铁/片×20南京金陵制药厂亚铁片钠、羟丙纤维素、硬脂酸镁、片/盒滑石粉、薄膜包衣预混剂82万方数据 卵转铁蛋白补铁产品的开发及其补铁功效的评价研究生期间取得的成果及参加的学术会议1.何恩祺，马美湖.卵转铁蛋白补铁剂的开发及铁代谢研究进展.第十一届中国蛋品科技大会论文集，2013,380-390.2.正在投稿文章―蛋白质螯合铁补铁剂研究进展‖3.正在撰写专利―一种新型蛋白质螯合铁补铁剂的配方‖4.参加第十一届中国蛋品科技大会暨国际蛋品研讨会5.参加国家蛋鸡产业技术体系2013年度总结暨考评会83万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士学位论文致谢一转眼便来到了华农，来到了蛋品团队这个大家庭；一转眼却又到了离别的时刻。太多的不舍，太多的感激，三言两语实显乏力，却也只能以此表达自己的心境。马美湖教授，我的导师，一位年过半百仍旧精力充沛，对科研事业兢兢业业的老师，他改变了我。马老师作为我国肉制品和蛋制品行业的资深专家，其专业知识的渊博、对待科研的严谨、对待科研工作既严肃认真又轻松愉快的态度在我的心底打下了深深的烙印，他经常对我们说的一句话是―做研究，要用儿时玩泥巴的心态，乐在其中‖，语言虽朴实，却道出了从事科研工作的真谛。在对学生进行指导时，从课题选定开始撰写文献综述，到每个章节的实验设计，再到最后的论文修改，每一句话、每一个标点符号，马老师无不反复斟酌，悉心教导。他经常对我们说：―学生是我事业的根本，学生的事一定是第一位的。‖我很庆幸自己能遇到这样一位优秀的导师。感谢蛋品团队这个大家庭，这里有全国最优秀的蛋品行业专家，有良好的团队合作氛围，有最先进的科研设备，为我的科研工作提供了最佳的平台。感谢蔡朝霞老师，黄茜老师，金永国老师，邱宁老师，靳国锋老师对我实验和生活的帮助和指导。感谢各位师兄师姐对我实验的指导和帮助。感谢12级的各位小伙伴们两年的陪伴。感谢宿舍的小伙伴们，我爱你们。感谢我的父母和家人，因为有你们的支持，才有我的今天。感谢自己，感谢你的坚持，感谢你没有放弃。迷惘与感悟、欢笑与泪水、成功或失败，本一，不二；唯有路漫漫要一直走下去，毕业只是另一个起点。84万方数据