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《引起鲟鱼暴发性死亡病因分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、引起勢鱼暴发性死亡病因分析2016年8月，河北省滦源县一家鲂鱼养殖场突发疾病，且出现大量死亡。为确定病原，从具有典型症状的患病鱼的肝、肾和脾中进行病原菌分离鉴定。经28*培养后，上述三个组织中均分离获得大量形态一致菌落。肝、肾和脾分离的病原菌分别编号为LY160816L.LY160816K.LY160816S,经形态特征、生理生化鉴定以及16SrDNA基因序列比对，鉴定结果为海豚链球菌。结合临床症状，综合判断,导致该场纟寻鱼暴发性死亡的病因是感染了海豚链球菌。近年来，中国的聲鱼养殖规模不断扩大，养殖产量逐年增加。随之而来的是养
2、殖勢鱼的疾病爆发更加频繁，严重制约药鱼养殖业的健康发展。目前，已报道的鲫鱼致病菌有嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonascarvia)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)和海豚链球菌(Streptococcusiniae)o2016年8月，河北省滦源县一家鲜鱼养殖场鲂鱼出现大量死亡，且持续时间长，累计死亡率达40%以上。其外观症状主要表现为口周围、腹部两侧骨板、肛门出血，疑似细菌感染
3、。为了搞清病因,作者对具典型症状患病纟寻鱼进行病原菌分离、生理生化鉴定以及16SrDNA基因序列比对。一、材料方法1•材料患病鲂鱼来自河北省滦源县鲂鱼养殖场。鲜鱼规格20cm〜30cmo2.主要试剂脑心浸液琼脂培养基购于北京陆桥生物技术有限公司。革兰氏染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。哥伦比亚血琼脂培养基和API20STREP鉴定试剂条购于北京威泰科生物技术有限公司oUNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒及PCR相关试剂购于上海生物工程有限公司。3•病原菌分离、纯化取具典型症状的患病歸鱼，无菌操作从肝、脾和肾划线分离于脑心
4、浸液琼脂（BHIA）平板和哥伦比亚血琼脂培养基，于289恒温培养箱培养20小时。挑取形态一致的优势菌落于BHIA平板进行纯化。菌株编号为编号LY160816L.LY160816K.LY160816So4.分离株的形态观察和生理生化特征纯化菌划线分离于BHIA,28*培养20小时观察菌落形态,进行氧化酶、触酶实验、革兰氏染色和API20STREP细菌鉴定试剂条鉴定生化特征。5.分离株的PCR鉴定、16SrDNA基因序列测定与系统发育分析病原菌的DNA模板制备采用UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒提取，置于-20£保存备用。细
5、菌16SrDNA序列扩增通用引物For:5&；acute；-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3damp；acute；,Rev：5&；acute；-TACGGCTACCTTGTTACGCTT-3&；acute；（退火温度55°C）,引物均由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系50&mu；L,包括10×；PCR缓冲液5&mu；L,25mmol/L氯化镁5&mu；L,5U/&mu；LTaq酶0.25&mu；L,10mmol/LdNTPl&mu；L,模板DNA2&mu；L,20pmol/&mu
6、；LJi下游引物各2&mu；L,DEPC水补至50&mu；LoPCR反应条件为941预变性5分钟，94。（2变性1分钟，退火温度退火1分钟,72£延伸1分钟，32个循环后721延伸10分钟，4匸保存。PCR扩增产物纯化后，由上海生工生物工程技术公司进行基因序列测定。将分离菌的16SrDNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，从中选取与所获序列同源性较高的同种菌株的16SrDNA基因序列，并从Genbank数据库中获得同属相关种的16SrDNA序列，利用MEGA4.0釆用邻位连接法（Neighbor-Jo
7、ining,NJ）构建系统发育树，通过自举分析进行置信度检测，自举数集1000次。二、结果1.临床症状患病鱼外观主要症状为口周围、腹部两侧骨板、肛门出血,解剖后发现肝、性腺和腹腔内膜有出血点，脾肿大。2•分离株的形态特征与生化特征分离菌在BHIA培养基上2MC培养24小时的菌落特征为：白色、圆形、边缘齐整、扁平、直径约0.3mm〜0.5mm。在血琼脂平板上28工培养24小时，菌落为圆形，中心白色，周边半透明，形成&beta；溶血环。氧化酶阴性，触酶反应阴性,革兰氏染色阳性，卵圆形，呈链状或双排链状（见图3）。采用API20ST
8、REP系统鉴定，菌株编号为LY160816L.LY160816K.LY160816S的三个样品与Buller等报道的国外分离株的生化特征在&beta；-葡萄糖醛酸酶、核糖和甘露醇项不同，而与Zhou等报道的中国分离株的生化特征完全一致。具体见表lo2.16SrDNA基因序列分
