第八章酶定向进化

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1、1/169蛋白质与酶工程ProteinandEnzymeEngineering1/169第八章酶定向进化DirectedEvolutionofEnzyme2/169主要内容第一节酶定向进化介绍第二节酶基因体外随机突变第三节酶突变基因的定向选择第四节酶分子定向进化的应用第一节酶定向进化介绍3/169获得具有新功能和特性的酶的途径(2)改造现有已知的酶。4/169(1)从大量未知的生物种系中寻找生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。酶保

2、证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。天然酶的作用5/1696/169天然酶的局限性酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求稳定性差活性低使催化效率很低缺乏有商业价值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。7/169现代生物工程对酶的要求1、能具备长期稳定性和活性2、能适用于水及非水相环境3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物4

3、、进一步增强酶对多种底物的分解能力生物的自然进化进化过程：突变→自然选择→遗传后代进化结果：基因多样性：为完成同一功能所表现出的多个基因或同一个基因(同源性)代谢途径的多样性：同样产物，多条途径代谢产物的多样性：同一底物，不同产物8/169如何利用相对简单快速的方法对天然酶的改造或构建新的非天然酶？9/169酶的人工改造酶的理性设计(Rationaldesign)酶的定向进化(Directedevolution)10/169酶的理性设计在对酶的空间结构和催化机理有非常充分了解的基础上，对酶的结构进行精确的调

4、控，从而获得具有所需催化活性的新酶11/169理性设计示意图12/169理性设计的不足只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶功能的改造较有限。本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力了。13/169定向进化定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。14/169定向进化示意图15/169定向进化的分类按照进化对象的不同，分为

5、：分子定向进化细胞定向进化16/169细胞定向进化细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的正突变频率。17/169分子定向进化分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错PCR、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技术

6、进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。18/16919/169酶分子定向进化模拟自然进化过程（随机变异和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。酶分子定向进化的原理定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的20/16921/

7、169酶定向进化的基本过程随机突变酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行易错PCRDNA重排基因家族重排平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法细胞表面展示法核糖体表面展示法高通量筛选定向选择定向进化的选择策略1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产

8、生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。22/169定向进化研究的历史1萌芽阶段首先在分子水平上进行改造单一分子的是SolSpiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体Q进行的试验,证明达尔文的自然选择也可在非细胞体进行.23/1692奠基阶段1981年，HallBG等报道了他们定向改变了大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。HallBG等利用lac