【精品】核医学体外分析教案-北大

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1、第一节放射免疫分析一、原理(一)基本原理放射免疫分析(RIA)的基础是放射性核素标记的抗原(radionuclidelabeledantigen)和非标记抗原(unlabeledantigen)(标准抗原或被测抗原)同时与限量的特异性抗体(specificantibody)进行竞争性免疫结合反应(competitiveimmunebindingreaction),其竞争关系可用下式表示:Ag+Ab<*^Ag-Ab+AgI*AgAV*Ag+*Ag-Ab式中：*Ag为标记抗原，Ag为非标记抗原，Ab

2、为特异性抗体，*Ag-Ab为标记抗原抗体复合物，Ag-Ab为非标记抗原抗体复合物。由于*Ag与Ag的免疫活性完全相同，对Ab具有同样的亲和力，当*人盘和Ab为恒定量，Ag和*人8的总量大于Ab上的有效结合点时，*Ag-Ab的形成是随着Ag量的增加而减少，剩下來的未结合或游离的*Ag则随着Ag量的增加而增加，称为竞争结合反应（competitivebindingreaction）,因此测定*Ag-Ab或*人盘即nJ••••••••••+♦ooooOOOOoooooooooooooooo2S■■■■

3、推出被测的Ag量（图13-1）o图13-1放射免疫分析原理示意图（二）标准曲线配制一系列已知浓度的标准抗原，分别向其中加入固定量的标记抗原和抗体，反应平衡后，分离抗原的结合部分和游离部分，测定*Ag-Ab的放射性B或游离*Ag的放射性F,计算岀结合率13%[13/（B+F）X100%]或其他指标，如B/Bo%（B°表示不含非标记抗原管的最大结合放射性）。以B%或B/弘%为纵座标，标准抗原的浓度为横座标，绘制曲线即为标准曲线（standardcurve）（图13-2）o依同法测得被测样品的B%或B

4、/Bo%,即可从此标准曲线上杳出样品中被测抗原的浓度。50XW02550100200400866^025501002（!）04008^6aAi啟度匕“区度标准曲线a.以B/Bt%为纵康标的标庭曲蛾b.以为纵冷怀的休厦曲纹e图13-2标准曲线二、基本条件_(-)特异性抗体1.抗体亲和力抗体亲和力(antibodyaffinity)是抗体与抗原之间相互作用的一种结合能力或强度。亲和力大即免疫结合既快又牢固，不易重新解离。kiAg+Ab<>Ag-Ab1<2亲和力的人小用亲和常数(affinitycon

5、stant)Ka值来表示，心=ki/k2,一般更求©值在10lo-1012L/M之间。亲和常数忆的计算最常用的方法是标准作图法：即以B/F为纵坐标，以[B]为横坐标，得到一条直线，其斜率的负数即为K“(图13-3)o图13-3标准分析图亲和常数K“还可利用常规RIA中的儿个参数进行计算:6XBo%Ka=(1-Bo%)(2—B。％)(4-Bo%)(3ED50-ED^)式中Bo%为零标准管的结合率，ED和和E%分别为结合率为50%和25%时对应剂量，可由标准曲线上杏得。1.抗体特异性指抗体分别与相应

6、抗原和抗原结构类似物的结合能力的比较。抗体与相应抗原结合能力强，而与该抗原结构类似物结合能力弱，则特界性高。抗体与抗原结构类似物的结合称交叉反应(crossreaction)。501002004008001600同类物(ng/al)交叉反应试脸交叉反应率二EDso(B)/EDso(A)X100%(图13-4)o图13-4交叉反应试验2.抗血清滴度以免疫反应屮所需抗血清(antiserum)的稀释度的倒数來表示，稀释倍数越高，滴度(titer)越高，表示抗体的效价越高。在实际工作中要找出抗血清的最

7、适稀释度，即与抗原比例最适当、检测抗原特异性最高、标准曲线斜率最大的稀释度(图13-5)。100图13-5抗血清滴度曲线测定方法：将抗血淸稀释成不同浓度，分別加入恒量标记抗原，经温育后分离B、F,求出不同稀释度的B%,以稀释度为横座标，B%为纵座标，绘制出抗血清滴度Illi线(antiserumtitercurve),一般以B%为30%〜50%的抗体稀释度为最适稀释度。(―)标记抗原对标记抗原的要求：1.比活度(specificactivity):比活度越高，灵敏度越高。2.放射化学纯度(rad

8、iochemicalpurity):指具有免疫活性的标记抗原的放射性占总放射性的百分率・一般要求大于95%o3.免疫活性：蛋白质分子上标记过多的碘原子就可能引起免疫活性的改变，一般以每个蛋白质分子上只标1〜2个1251原子为宜。4.稳定性。(三)标准品_1.对标准品的要求1.标准品(standard)与被测物应属同一种物质2.在与抗体发生反应时，应与被测物具有相等的活性和亲和力3.高度纯化4.定量精确1.标准品的级别国家标准：是高度纯化的标准品，并与各国的标准及世界卫生组织(WHO)的标准进行过