叶瓜参多糖活性成分药性分析

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1、叶瓜参多糖活性成分药性分析海参为海洋棘皮动物，营养丰富、味美可口，具有极高的药用价值，同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一。明代以后，海参收录于本草，作为补益药物口］。现代研究表明，海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老、防止动脉硬化、糖尿病以及抗肿瘤等作用［2］。叶瓜参(CucumariafrondosaGunnerus)属棘皮动物门(Echinodermata海参纲(Holothurcidea楣手目(Dendrochirotida瓜参科(Cucumariidae)的海洋动物。体长一般为50mm,体型nn呈圆筒状，体色为棕色或黑色，具有较厚的体壁和

2、坚硬的角质，触手为5个。该物种广泛分布于北极地区，俄罗斯、加拿大、挪威、英国等国海岸均有分布，此外从格陵兰到马萨诸塞的西大西洋水域也有分布［3］。多糖是海参的主要活性成分，主要有黏多糖岩和藻多糖两种［4-5］o国外学者对叶瓜参中的皂昔有过研究［6-7］,但有关叶瓜参多糖的研究鲜有报导。本课题组先期对叶瓜参中的脑昔脂进行了研究［8］。本研究对加拿大纽西兰海域的叶瓜参(C.frondosaGunnerus)中的多糖成分进行了系统的化学分析和生物活性研究。1?仪器与材料1・1?实验材料叶瓜参新鲜样品，2010年9月采自加拿大纽芬兰海域,标本保存于第二军医大学海洋

3、药物研究中心。1.2?仪器GL-20G-II冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂:Alpha-1-2冷冻干燥仪，CHRIST（德国）；超滤装置，上海摩速科学器材公司；BS110分析天平，Sartorius北京赛多利斯天平有限公司；BSZ-100自动馆分收集器，上海青浦沪西仪器厂；GC/MS:FinniganVoyagerGC/MS联用仪,配DB-5石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm,0.25μm'HPLC条件：AglientHOOHPLC仪，示差折光（RID）检测器。1.3?试剂葡聚糖凝胶，SephadexG-25上海仕梵化学有限公司；盐酸

4、、硫酸、苯酚等均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。2?方法与结果2.1?实验方法241?叶瓜参多糖的提取分离？取叶瓜参新鲜样品，冷冻干燥，粉碎成20目冻干粉。将叶瓜参冻干粉1000g加入5倍量的60%乙醇冷浸并搅拌5ho离心收集上清液，沉淀物>24]继续按上述步骤重复提取2次，合并上清提取液，减压浓缩,得乙醇提取物。将乙醇提取物用5倍量水溶解，Sevage法去蛋白。水层溶液减压浓缩，冷冻干燥，即为叶瓜参粗多糖,称重，计算其得率为5.2%o将叶瓜参粗多糖样品溶解于25倍量的蒸馆水中，利用超滤装置，选用不同的超滤膜（截留分子量为10KDa、5KDa和5

5、00Da）对叶瓜参粗多糖进行梯度超滤，得不同分子量的截留液。减压浓缩，冷冻干燥，得不同分子量范围的叶瓜参多糖。242?叶瓜参多糖的纯化？所得到的样品再分别进行葡聚i>Z<]糖凝胶SephadexG-25柱层析，蒸馆水洗脱，硫酸'苯酚法跟踪检测洗脱液中的多糖含量，收集均一多糖组分。从分子量为10KDa的截留液中分离得到CFG-1（得率为5.4%从分子量为5KDa的截留液中分离得CFG-2（得率为6.3%从分子量为500Da的截留液中分离得CFG-3（得率为6.7%）b上述叶瓜参多糖组分经HPGFC检测均单一吸收峰，经紫外扫描不含蛋白质和氨基酸。2.1.3

6、?叶瓜参多糖酸水解？取已纯化的叶瓜参多糖各5mg,溶于2.5mL三氟乙酸溶液中，置于5mL安甑瓶中，充氮气后进行封管。置于水浴中加热反应5h,然后取出减压浓缩至干。加入5mg盐酸軽胺和毗味1.5mL,置于90°C水浴反应30min，冷却至室温，加入1mL醋酹,909水浴反应45min,生成糖睛乙酸酯衍生物，溶于0.5mL氯仿溶液，进行GC-MS分析。GC-MS分析条件：色谱柱HP・5石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm,0.25μm）;柱温150°C（保持2min）-300°C（保持10min）汽化温度250°C;升温速度15°C/mi

7、n;载气（流量）氮气（1.0mL/min）;质谱检测器源温200°C.El电离源、电离电压70eVo根据样品测得的吸收峰的保留时间与标准糖进行对照，确定糖的组成。根据样品测得的吸收峰的面积推测糖的摩尔数比。244?叶瓜参多糖蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制活性试验？实验材料和方法：应用大肠杆菌表达后得到蛋白酪氨酸磷酸酶PTPIBo实验中，以pNPP为底物，在96孔或384孔平底微孔板内检测酶活性。底物pNPP经PTP1B水解获得的游离产物在405nm处有非常强的光吸收，通过酶标仪监测405nm处光吸收强度变化，计算出样品对酶活性的抑制率（%inhibitio

8、n2.2?实验结果CFG-1由木糖、3■甲氧基葡萄糖和葡萄糖组成