《分子生物学》实验考试答案整理小抄版（呕心沥血整理）

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1、一、名词解释：1、聚合酶链式反应是模拟DNA的复制过程，在体外特界性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同—序列DNAo2、质粒存在丁•许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够I'］主复制的很小的环状DNA分子。3、星号活性在菲理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出,这种”星号”活性可能是内切酶的i种普遍特性(1)如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。4、限制性内切酶可以识别DNA的特界序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。5、转化是某

2、一棊因型的细胞从周围介质中吸收來向另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。该现彖首先发现于细菌。6、转化子受体菌直接吸收了来口供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组屮，从而获得供体菌部分遗传性状的现彖转化后的受体菌，称转化了transformant7、重组子两个突变位点Z间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。重组子(recombinant)另_定义是指，含有重组DNA分子的转化细胞。8、感受态细胞细胞经过一些特殊方法(电击法、CaC12法、RbCKKCl等化学试剂法)的处

3、理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Componentcells)。二.深刻理解和掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理，以及溶液I、溶液II和溶液III的主要成分及其在实验中所起的作用。为何出现较多的RNA污染，如何解决RNA污染的问题？(碱裂解可以利用变性和复性的差异较有效地区分质粒和较大的DNA(如基因组DNA),但是不能区分同样是较小分子的RNA和质粒DNA,因为两者虽然有单链和双链的区别，RNA内部可形成二级结构，但是他们的分子量差异不大，变性和复性行为上没有差异。加入RNA酶可

4、水解RNA污染。)•基本原理质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异來达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，山于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的盘键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在-起。当加入中和液后，溶液pH调恢复至中性，在窩盐浓度的情况下，染色体DNAZ间交联形成不溶性网状结构并与蛋门质・SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清屮。这样，通过离心可沉淀大部分细胞

5、碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀厉上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNAo溶液I:葡萄糖(50mmol儿)Tris・HC1(25mmol/L»pH8.0)EDTA(lOmmol/L)溶液II：NaOH(0.2mol/L):SDS(1%,新鲜配制，常温保存)溶液III：60ml5mol/LKAC；11.5ml的冰醋酸；28.5ml水溶液I低浓度的匍萄糖溶液使细胞处丁•低渗状态而细胞澎胀；匍萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程屮的机械剪切作用，防止破坏DNAoEDTA的作用是螯合掉Mg2+.Ca2+等二价金属离子，

6、防止DNA酶对质粒分子的降解作川。Tris・Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范MoSDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使Z变性。NaOH(pH>12)的作用:破坏氢键，使DNA分子变性。KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能屮和溶液II的碱性，使DNA复性。K+会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋口质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋口质-SDS形成和互缠绕的人分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。三、如何判断DNA酶切是否完全？若没有完全酶切，应如何改进实验。取未酚切处理和師切处理的DN

7、A样在1.2%琼脂糖凝胶屮电泳，与未酶切DNA电泳条带相比,酶切处理的DNA样品电泳速度较慢，条带滞后，则已完全腮切；若条带与未悔切处理条带一致，则完金没有酶切效果；若同时出现这样的两条带，则不完实验改进：影响酚切的因素：DNA的纯度、缓冲液屮的离子强度.Mg2+等可通过增加限制酶的用量,延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注虑的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成菲特异性的酶切四、深刻理解和掌握蓝白斑筛选阳性重组子的原理。蓝11斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根拯载体的遗传特征筛选重组子，如a■互补.抗牛索基因等。现在使用的许多

8、载体都带冇一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有B•半乳糖昔酶基WdacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框,但可使少数儿个氨基酸插入到B•半乳糖昔酶的氨