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1、XCL1基因论文：猪XCL1基因原核表达、多克隆抗体制备及产物活性鉴定【中文摘要】趋化因子(chernokines,chemoattractantcytokines)是能够使细胞定向移动的小分子细胞因子，在促使细胞迁移和活化过程中发挥重要作用，对机体的免疫系统非常重要。淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin,Lptn)是C族趋化因子的一员，也被称为淋巴趋化因子配体1(XCL1)。淋巴趋化因子受体XCR1与XCL1相互作用参与呈递抗原、激活T淋巴细胞和NK细胞,发挥机体的细胞免疫功能，能够调节免疫系统平衡，增强粘膜免疫、抗肿瘤免疫，在感染性疾
2、病过程中诱发炎症反应等。柳超等已构建pEGFP-PLptn真核表达载体，证实绿色荧光融合蛋白在体外具有趋化活性，但并未进行进一步的研究。本研究首次构建了原核表达载体pET-32a-XCLl,摸索了原核表达的最佳诱导和纯化条件，采用IliTrapTMChelatingIIP纯化蛋白，SDS-PAGE检测重组蛋白纯化情况,Western-blot检测重组蛋白表达情况。并以此重组蛋白作为抗原，制备多克隆抗体，双向琼脂扩散试验、间接ELISA检测多克隆抗体效价,MTT法检测猪XCL1对淋巴细胞增殖的影响,为研究XCL1在猪中的功能提供了素材。主要研究内
3、容与结果如下：1•根据NCBI上猪XCL1基因序列，设计引物,从猪淋巴结克隆得到0.27kb的片段。将片段克隆至PMD-19T载体中，筛选出阳性质粒送测序,结果表明该片段序列正确。2.将基因构建到原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达，纯化蛋白，免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。3.双向琼脂扩散试验显示抗原抗体的结合比为1：&间接ELISA检测到抗体效价达到1:12800o4.通过MTT法试验检测重组蛋白XCL1对淋巴细胞增殖的影响，结果表明重组蛋口XCL1能促进淋巴细胞的增殖，而此实验制备的多克隆抗体可以
4、阻断这种效应。【英文摘要】Chemokines(chemoattractantcytokines)arecytokinesofsmallmolecularsizethatcaninducedirectedchemotaxis,andplayanimportantroleintheprocessofcellmigrationandactivation.Thus,chemikinesareveryimportantcomponentsintheimmunesystem・Lymphocytechemotacticfactor(Lymphotactin
5、,Lptn),alsoknownaslymphoidchemokineligand1(XCL1),isamemberofCchemokinefamily.TheinteractionbetweenXCR1andXCL1involvesinantigenpresentation,TlymphocytesandNKcellsactivation,andthecellularimmunefunctionexertionprocesses,thuscanregulateimmunebalanceandinduceinflammatoryreaction
6、intheprocessofinfectiousdisease,andcanenhancemucosalimmunityandanti-tumorimmunity.Liuetal(2010)hadconstructedeukaryoticexpressionvectorpEGFP-PLptn,andconfirmedthatthefusionproteinwithgreenfluorescentmarkerdisplayschemotacticcharacteristicinvitro,butfurtherstudywasnotcarriedo
7、ut・Inthisstudy,wefirsteverconstructedprokaryoticexpressionvectorpET-32a~XCLlandfoundouttheoptimumconditionsofitsexpressionandpurification.First,purifytherecombinantproteinusingHiTrapTMChelatingHPchromatographiccolumn.Second,checkthepurifiedproductusingSDS-PAGEtechnique・Third
8、ly,detecttheexpressionoftherecombinantproteinusingwestern-blot・Immunizethee
