动物线粒体基因组全序列测定的研究策略【文献综述】

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1、毕业设计文献综述生物科学动物线粒体基因组全序列测定的研究策略摘要：动物线粒体基因组全序列测定是近年来生物学研究中的一个热点。科学技术的发展，对动物线粒体基因组全序列测定的研究策略也产生了深远的影响。在此对几种在动物线粒体基因组全序列测定中常用的几种策略进行了综述，并对其优缺点进行了比较分析。关键词：线粒体基因组全序列氯化铯密度梯度离心法差速离心法L-PCR前言：线粒体是真核细胞内的一种十分重要的细胞器，是细胞进行氧化磷酸化的场所。动物线粒体基因组具有相对较小(约为15～19kb)、结构简单、母系遗传和进化速率快等特点[1]。在分子生物学研究方面，其不仅是研究DN

2、A结构与复制转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成的模型系统。此外，线粒体基因组作为一种分子标记，广泛应用于动物界不同等级阶元系统发育的研究[2-5]。自1981年4月9日，英国《Nature》杂志公布人类线粒体基因组全序列以来[6]至2008年3月；在不足30年的时间内，NCBI中共收录了后生动物的线粒体基因组全序列1195条，其中，六足动物线粒体基因组全序列81条，研究范围涉及六足总纲的18个目。动物线粒体基因组全序列的研究方法，通过逐渐改进趋于成熟，本文对其发展进行了综述。1　基于物理分离策略的方法在PCR技术引入线粒体DNA(简称mtDNA)分

3、离以前，对于线粒体基因组全序列的测定，主要包括以下2部分内容:(1)高纯度mtDNA的获得;(2)mtDNA片段化成适于克隆测序的短DNA片段。1.1　高纯度mtDNA的获得高纯度mtDNA的获得,主要有密度梯度离心法和差速离心法。此外,还有在此基础上进行局部优化的方法,如DNase法、碱变性法和改良的碱变性法等[7-8]。1.1.1　氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心，不事先制备密度梯度，而是制备6mol/L氯化铯溶液，5待分离的大分子溶解在氯化铯中时，置于高离心场中，氯化铯开始沉降;经过几小时后达到平衡，形成稳定的氯化铯密度梯度，大分子混合物按照颗粒的密

4、度分布，在各区带中被分开。此法可获得极高分辨力，特别适用于分离不同类型的核酸[9]。1.1.2　差速离心法差速离心法，又称为分级离心法，由Tamura和Aotsuka最早建立，由于组织匀浆后的混合液中，不同组分的质量不同，利用在离心力场下沉淀它们的离心力不同的原理将组分分离。为了获得特定的组分，通常需要进行一系列的离心。首先选择较低的离心速度和较短的离心时间，将不需要的大粒子沉淀去除后，再选择较高的离心速度和较长的离心时间，将所需的组分沉淀下来，而大多数更小的粒子则留在上清液中。去除上清液后，再以相同的介质将沉淀悬浮后，重复上述的差速离心；如此反复多次，直到获得

5、纯度较高的特定组分。获得纯度较低的线粒体后，再通过DNase消化附着在线粒体表面的核DNA，碱变性，高浓度盐溶液复性，最终获得高纯度的mtDNA[7,10]。如鲁成等利用差速离心法获得线粒体后，在DNase法和碱变性法基础上建立的改良后的碱裂解法对家蚕mtDNA进行提取[11]。Saito等利用差速离心法对果蝇属Drosophila4种果蝇、红粉甲虫Triboliumcastaneum、飞蝗Locustamigratoria和家蚕Bombyxmori的线粒体DNA进行了分离[12]。1.2　线粒体DNA片段化上述方法获得mtDNA通常通过限制性内切酶消化或超声波

6、随机打断的方法，片段化为适合克隆测序的短DNA片段。1.2.1　限制性内切酶消化选用切割位点较少且分布较均匀的1种或几种限制性内切酶对mtDNA进行完全或不完全消化，形成长度约为数百碱基不等的短DNA片段，利用脉冲场凝胶电泳将各种长度的DNA片段充分分离，并最终将其克隆至质粒载体中进行测序[13-14]。如Crozier和Crozier利用限制性内切酶EcoRI，BclI和BglII对蜜蜂Apismellijeru线粒体DNA进行切割后克隆至pUC8或pUC18。此外，使用AccI对mtDNA进行切割，使用DNA聚合酶I对Klenow片段末端进行修饰后，经Bcl

7、I或EcoRI切割后克隆至pUC18。除最小的AccI片段(527bp)外，克隆片段几乎覆盖了蜜蜂mtDNA的所有区域。pUC克隆被亚克隆至M13mp8，M13mp18和M13mp19后进行序列测定[15]。1.2.2　超声波随机打断获得的mtDNA，利用不同强度的超声波随机打断，形成短DNA片段后，克隆至质粒载体中进行测序[11]。如鲁成等将差速离心法获得的家蚕mtDNA，经超声波随机打断后，回收长度为1.5～3.0kb的DNA片段，并克隆于pUC18载体，挑取300个克隆进行重组质粒测序[11]。52　基于常规PCR技术的方法参考公布的线粒体基因组研究通用引

8、物[16]，或通过近源物