舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列分析

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1、舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列分析【摘要】【目的】对2条舟山眼镜蛇的线粒体基因组全序列进行了测定和分析,并初步探讨其系统发育地位。【方法】结合PCR产物TA克隆和步移测序技术,基于除nad6外12个蛋白编码基因的合并序列及其翻译的氨基酸序列,以蜥蜴为外群,用NeighborJoining(NJ)法构建了7种蛇的系统发育树。【结果】两者在长度上仅相差2bp,基因含量和排序完全一致,共编码37个基因(2个rRNA、22个tRNA和13个蛋白),其中tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASe

2、r(U)、tRNAGlu、tRNAPro和nad6由轻(L)链编码,其他均由重(H)链编码。13个蛋白编码基因的排列次序和相对位置与其他蛇类完全一致,起始密码子除cox1使用GTG外,其余均为ATG;与此同时,除nad1/4L/5、cox1和atp8外,其他均为不完全的终止密码子TA或T。NJ树分析发现,眼镜蛇科与游蛇科亲缘关系最近,随后依次与蝰科和蟒科聚在一起,各分支的支持值均高达90%以上。【结论】本研究证实了基于全线粒体基因组合并序列进行蛇类物种系统发育研究是可行的。【关键词】舟山眼镜蛇;基因组学;控制区;系统发育;线粒体　

3、　舟山眼镜蛇,又叫“中华眼镜蛇”,拉丁名为“Najaatra”,英文名包括“Zhoushancobra”、“Taiata)蛇亚目(Serpentes)眼镜蛇科(Elapidae)眼镜蛇属(Naja),主要分布于我国南部、台湾岛和越南北部,在《濒危野生动植物物种国际贸易公约(CITES)》附录中被列为Ⅱ级保护动物。　　目前,GenBank中来自蛇类物种的核酸序列主要集中在蛇毒蛋白及代表性的核和线粒体基因片段,有关mtDNA全序列的报道则比较少。Kumazaicarinatus”的线粒体基因组全序列，Dong等[2]继续测定了另外7种蛇的

4、全序列，严洁[3]、李洪丹[4]和Jiang等[5]又提交了4种蛇的全序列。　　为给保护生物学、进化遗传学和物种鉴定等相关领域的基础研究和实际应用提供帮助,本研究在测定舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列的基础上,结合PCR产物TA克隆和步移测序技术，利用合并的12个重链(H链)编码的蛋白基因及其翻译的氨基酸序列组合数据,对蛇类物种的系统发育关系进行了初步的分析,现报道如下。　　1材料与方法　　11主要试剂及仪器离心柱型基因组提取试剂盒(北京天根公司,DP303型),分子量标记(北京天根公司,DNAMarkerIII),蛋白酶K(美国Amr

5、esco公司,批号：0706),引物(北京赛百盛公司,人工合成),脱氧核苷酸混合物(dNTPs)、PCR缓冲液和DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司,型号ExTaq),T载体(大连宝生物工程有限公司,型号pMD18T)，大肠杆菌感受态细胞(北京索莱宝公司,DH5α)，PE2400型PCR扩增仪(美国PerkinElmers公司),3730XL型96道毛细管基因分析仪(美国ABI公司),GDS8000型凝胶成像系统(美国UVP公司),Poa公司)。　　12样品和总DNA提取舟山眼镜蛇购于广州加雨蛇场,蛇全体标本经鉴定后保存于

6、中国科学院成都生物研究所两栖爬行动物标本馆(样品凭证号：CIB093930和CIB093931,鉴定人：赵尔宓)。少量新鲜蛇肌肉组织立即使用或-80℃保存,总DNA提取参照DP303离心柱型基因组提取试剂盒提供的说明书进行。洗脱得到的DNA溶液经测定D260和D280粗略估计浓度和纯度后,稀释至100ng/μL,分装于-4℃短期保存备用。　　13引物设计、PCR扩增、TA克隆、步移测序和序列拼接参照GenBank公布的蛇类物种序列,采用生物信息学分析软件ClustalX18进行多序列比对,在系统总结前人设计的通用引物的基础上,

7、对部分引物进行了修改,最终筛选得到9对引物,扩增片段大小为15～3kb,保证相邻片段间重叠大于200bp(重叠率约为23%,数据待发表)。PCR扩增、TA克隆和步移测序具体步骤参见文献[6]。采用SeqManII71和Chromas233分析软件对测序结果进行人工校对和拼接,得到舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列。　　陈念.舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列分析第5期14基因定位、序列分析和提交以首次鉴定的半棱鳞链蛇线粒体基因组全序列(Dinodonsemicarinatus;NC001549)为参照,结合tRNAScanSE121

8、[7]定位了21个tRNA基因,随后通过ClustalX18分析软件进行多序列比对,对剩余的1个tRNASer(AGY),以及所有的蛋白编码基因、rRNA基因和控制区进行了定位。采用Editseq71软件统计序列总长