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时间:2019-09-19
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1、基因芯片技术及其在疾病基因诊断中的应用摘要:基因芯片技术是伴随着人类基因组计划的实施而发展起来的生命科学领域里的前沿生物技术。它最显著的特点是高通量、高集成、微型化、平行化、多样化和自动化。经过短短十几年的发展,基因芯片技术现已在基因表达分析,基因突变及多态性分析,疾病基因诊断,药物及毒物基因组学等多个领域显示出重大的理论意义和实际应用价值,具有广阔的前景。本文专门介绍了基因芯片技术及其在疾病基因诊断上的应用。关键词:基因芯片技术;疾病;基因;诊断基因芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术,在固相支持物表面(常用的固相支持物有玻璃、硅片、尼龙膜等载体)有规律地合成
2、数万个代表不同基因的寡核昔酸“探针”或液相合成探针后由点样器有规律地点样于固相支持物表面,然后将要研究的目的材料中的DNA、RNA或cDNA用同位素、生物素或荧光物标记后,与固相支持物表面的探针进行杂交,通过放射自显影或荧光共聚焦显微镜扫描,对这些杂交图谱进行检测,再利用计算机对每一个探针上的杂交信号作分析处理,便可得到目的材料中有关基因表达信息。该技术可将大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可对大量核酸分子进行检测析。1基因芯片技术的四个技术环节1.1芯片的制备主要是原位合成法和直接点样法。原位合成法适用于寡核昔酸;点样法多用于大片段,有时也用于寡核昔酸。原位
3、合成法:它是利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置准确、高度多样化的化合物集合。在合成前需要先对介质进行处理,使之衍生出轻基或氨基,并用光敏保护基团将其保护起来,合成所用的单体分子3'端用固相合成法活化,5'端用光敏保护基保护,在合成过程中,通过蔽光膜使特定的位点透光,其余的位点不透光,只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体相连,合成的第一步是利用光照射,使介质表面上的轻基脱保护,然后介质表面与光敏保护基保护、亚磷酰氨基活化的碱基单体接触,一个5'端被保护的核昔酸单体就连接上去,反复这个过程,直到合成一段所需长度的寡核昔酸为止。直接点样法:该方法是在片基以外
4、,事先合成好寡核昔酸探针,然后利用共价键连接到片基上。片基以外DNA探针的获取可采用常规的分子生物学手段,如PCR扩增DNA片段,RT-PCR获得的cDNA,cDNA文库中获取的单一、纯化的cDNA,基因克隆技术获取的DNA以及人工合成的DNA等。合成好的寡核昔酸探针主要利用共价键连接在片基上,主要有以下几种方法:硅烷化寡核昔酸探针直接点样于玻片上制成寡核昔酸微阵列;硫代寡核昔酸探针通过二硫键与疏基修饰的玻片连接;氨基修饰的玻片与5'末端带氨基的寡核昔酸探针通过共价键连接;丙烯酰胺硅烷化的基片与亍-丙烯酰胺修饰的寡核昔酸探针连接。1.2样品制备与标记从待检细胞或组
5、织中分离出DNA或RNA,经逆转录、PCR扩增、末端标记等操作,标记主要有荧光标记,生物素或同位素标记,现在常用荧光素标记,以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。1.3杂交反应基因芯片杂交反应过程十分简便。但杂交条件的选择需考虑多方面的因素,如杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。由于基因芯片影响因素很多,所以要合理设置异种核酸平行实验、核酸质量、检测对照、封闭对照、归整化对照,以保证结果的准确性和重复性。最近,为提高芯片杂交的准确性,出现了肽核酸芯片,肽核酸是以中性酰胺键为骨架的一类新的DNA类似
6、物,对核酸有着独特的序列识别功能它不带电荷,与核酸杂交时不存在静电排斥作用,故PNA与互补的DNA或RNA杂交时,比类似的DNA寡聚物有着更高的亲和性,而且PNA很稳定,对提高基因芯片的检测效果,防止假阳性方面有一定的进步。1.4信号检测和分析常用的芯片成像分析系统有激光共聚焦扫描仪和电荷耦合(CCD)扫描仪。前者的激光光源可产生激发不同荧光染料的光。当探针与待测核酸完全正常配对时的荧光信号强度是具有单个或2个错配碱基探针的5~35倍,而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。CCD扫描仪将图像分成若干小块,测定每个小块中的平均荧光强度,进而求阵列
7、中每个点的相对荧光强度,通过计算机处理获得结果。2基因芯片技术在疾病基因诊断方面的应用2.1基因表达分析一用于疾病机制的研究基因芯片常用于检测一组细胞中全部基因在特定时刻的表达谱。通过将提取的总mRNA反转录为cDNA并杂交到具有不同基因探针的DNA芯片上,就可得到不同基因在不同条件、不同发育阶段下的表达情况。通过比较不同条件下的基因表达谱差异,可发现与某种疾病或者特殊病理相关的特定类型基因,并可进一步用于临床诊断或基因工程等。与传统的分子诊断技术相比,DNA芯片技术采用了I)NA集成的方式,改变了以前的孤立的研究单个基因在某个特定位置、特定时间表达的状况,可以对
8、人体600
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