02钉螺血吸虫感染的环介导等温扩增技术检测操作说明

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1、钉螺血吸虫感染的环介导等温扩增技术检测（LoopMediatedIsothermalAmplification,LAMP）一、实验器材和主要试剂准备1•仪器设备台式高速离心机（1.5/2.0ml离心管转头，转速要求＞10,000r/min）；恒温水浴箱（可调温37〜65°C）；迷你（微型）离心机（0.2ml离心转头）;漩涡震荡器；电动组织研磨器；移液器一套（量程包括100或200-1000^1,20〜200（11,0.5或1川〜10

2、.il）；耗材：Tip头、1.5和2.0ml微量离心管、0.2

3、mlPCR反应管、厚玻璃板、乳胶手套或一次性手套、一次性口罩2.主要试剂试剂盒：细胞（组织）基因组DNA提取试剂盒，钉螺体内血吸虫核酸检测试剂盒。二、操作流程1、操作者首先穿好工作服，戴好干净口罩和手套，整理实验桌台面，建议用DNA酶变性剂喷在移液器、实验台面，去除环境中外源DNA的污染。2、从现场获取的钉螺若干只，按照以下步骤进行样品预处理和钉螺基因组DNA提取：（1）用（pH&0）灭菌TE缓冲液漂洗钉螺2遍,干净吸水纸上晾干。(2)取同一个环境的钉螺10只置干净厚玻片上，压碎钉螺；(3)用干

4、净银子去大部分钉螺外壳，挑取钉螺软体组织置干净2.0mL微量离心管内，加400卩1缓冲液GA,振荡至彻底悬浮；40山蛋白酶K液，置冰上用电动研磨器研磨软体组织，工作条件15s,间隔5s,共2次；(4)将研磨处理的钉螺样本放置56°C水浴充分裂解，期间每30min取出离心管放置振荡器上充分混匀30s,水浴时间2〜3h(或过夜)从水浴箱中取出裂解样品管，继续行基因组DNA提取；(5)加入400pl缓冲液GB,充分颠倒混匀，70°C放置10min,溶液应变清亮，10s简短离心以去管盖内壁的水珠。注意：

5、加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70°C放置吋会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯；(6)加入400pl无水乙醇，充分振荡混匀15sec,此时可能会岀现絮状沉淀，10s简短离心以去除管盖内壁的水珠；(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)□12,000rpm(~13,400xg)离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(8)向吸附柱CB3中加入500)11缓冲液GD(使

6、用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(〜13,400xg)离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；(2)向吸附柱CB3中加入600

7、11漂洗液PW(使用前请先检查是否己加入无水乙醇),12,000rpm(〜13,400xg)离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；(3)重复操作步骤(9)；(4)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(〜13,400xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

8、注意：这一步的冃的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(LAMP、PCR等)实验；(5)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60〜80卩1洗脱缓冲液TE,室温放置10min,12,000rpm(〜13,400xg)离心2min,将溶液收集到离心管中。收集离心管内液体，即钉螺基因组DNAo(6)将来自同一个环境中的钉螺基因组DNA进行混合样木的处理用于后续LAMP反应，即分别从每个管中吸取10(11钉螺基因组DNA溶液，按每50个钉螺基因组

9、DNA为一个混合样本，剩余DNA样本・20°C冻存备用。2.LAMP实验：1)反应体系配制：按25)11反应体系进行LAMP反应。按照设计，取无菌消毒处理的0.2mlPCR反应管，分别加入DNA模板2ul、2xLAMP反应缓冲液12.5

10、il>25x引物混合液l.Oul、灭菌蒸馄水7.5山、BstDNA聚合酶1.0pil,加入1山钙黄绿素显色试剂、轻弹管壁混匀反应体系，用微量离心机离心5s；2）等温扩增反应：将上述配制好反应体系的0.2ml离心管插入浮标孔内，放置65°C恒温水浴锅，恒温孵育60

11、〜90mine3）结果判定：肉眼观察反应管内液体颜色变化，液体变成绿色判定为阳性；阴性为（棕）黄色。若阴、阳性钉螺样本反应管内液体均显示绿色，说明实验室或检测系统可能受到日本血吸虫DNA污染，需重新试验。4）将上述反应管置85°C水浴5min终止酶促反应，反应管置黑色背景下照相留作实验原始记录。