PKCδ-Cdc25B通路对小鼠受精卵早期发育调控机制的研究

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1、分类号：R329.28单位代码：10159密级：公开学号：201010025博士学位论文中文题目：PKCδ/Cdc25B通路对小鼠受精卵早期发育调控机制的研究英文题目：StudyonthemechanismofPKCδ/Cdc25Bpathwayinearlydevelopmentoffertilizedmouseeggs论文作者：刘艳春指导教师：于秉治教授学科专业：生物化学与分子生物学完成时间：2018年10月中国医科大学博士学位论文PKCδ/Cdc25B通路对小鼠受精卵早期发育调控机制的研究Studyonthemech

2、anismofPKCδ/Cdc25Bpathwayinearlydevelopmentoffertilizedmouseeggs论文作者刘艳春指导教师于秉治教授申请学位理学博士培养单位生命科学院一级学科生物学二级学科生物化学与分子生物学研究方向受精卵发育机理的研究、分子生殖生物学论文起止时间2012年3月—2018年10月论文完成时间2018年10月中国医科大学（辽宁）2018年10月中国医科大学博士学位论摘要目的：自1977年发现以来，蛋白激酶C（PKC）作为细胞内信号转导体系中的一个重要激酶，参与了细胞内的不同类型的生

3、命形式，包括细胞的生长、细胞分化，进而调节细胞周期，PKC参与的细胞调亡可能和肿瘤发生有关，在很多疾病的发生发展过程中也起到重要作用。PKC的多种亚型在不同细胞中的定位、表达和功能的不同，为PKC能够在多种信号传递系统中发挥作用提供了重要基础和保证，由于细胞可以同时合成不同亚型的PKC,导致PKC参与生长调控的分子机制变得更加复杂和多样化。细胞周期的调控是一个复杂的过程，受控于多种磷酸酶与磷酸激酶作用下的中心调控体系。作为PKC家族的一员，PKCδ是参与细胞内外信号转导的一个重要激酶，因此，探讨PKCδ信号通路在细胞周期调

4、控中的作用，具有重要意义。Cdks是周期蛋白(cyclin)依赖性激酶，与周期蛋白结合活化后，共同对细胞周期进行调节。在细胞周期中，cdks参与调控G2/M的转换。Cyclin作为cdks的调节亚基，与其结合后形成Cyclin/cdk复合物，当cdks处于活化状态时，从而发挥对细胞周期的调控作用。MPF为异二聚体，是G2/M转换的调节者，由Cdc2和CyclinB构成。有丝分裂前，由于Cdc2的Tyr15和Thr14残基发生磷酸化，Cdc2处于失活状态，形成M期促进因子(MPF)的无活性前体，在有丝分裂期MPF可以被Cdc

5、25活化，这两个位点被去磷酸。G2向M期的转换离不开Cdc2的调控，在Cdc25B磷酸酶的作用下，Cdc2发生去磷酸化后被激活，从而激活MPF，使早期有丝分裂开始启动。卵母细胞能够快速恢复到减数分裂的进程中去，也主要受到Cdc25B的调节。小鼠受精卵的早期发育过程，尤其是1-细胞期向2-细胞期的转换机制是国际上研究的热点和难点。PKCδ在MⅡ,2-细胞期小鼠受精卵中均被检测到，但它对受精卵早期发育调控机制少有报道，本实验室前期研究表明PKC可通过激活MPF促进小鼠受精卵的发育，且PKC在M期的活性增强，还有研究认为PKCδ

6、组成了PKC活性的大部分，PKCδ在M期的表达量增多很可能和PKC在M期的活性增强有关，本实验以小鼠1-细胞期受精卵为研究对象，观察了PKCδ在小鼠1-细胞期受精卵四个分期中的mRNA和蛋白水平的表达及定位，并利用PKCδ的抑制剂Rottlerin以及特异性的siRNA处理1-细胞期受I中国医科大学博士学位论精卵，观察受精卵细胞的分裂情况，探讨了PKCδ在小鼠受精卵早期发育过程中的作用及其机制。应用Scansite软件预测Cdc25B-Ser96(96位丝氨酸)可能为PKCδ特异性磷酸化位点，在哺乳动物细胞内Cdc25B是

7、否为PKCδ的直接作用底物，Cdc25B-Ser96对小鼠受精卵细胞周期的调节作用尚未见报道。因此，进一步观察PKCδ/Cdc25B信号转导通在小鼠l-细胞期受精卵发育中的调控作用，尤其是G2/M转变过程中对Cdc25B和MPF的调控作用，对阐明PKCδ调控哺乳动物细胞周期的机制有重要意义。研究方法：本研究选用昆明系SPF级小鼠，雌性4-6周，20-24g,雄性8周，30-35g,都来自于中国医科大学实验动物中心，通过分别对小鼠进行腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnantmare’sserumgonadotropin,

8、PMSG)及人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)超排卵和受精，取小鼠受精卵放入M16培养液中培养至指定时间收集G1,S,G2,M期受精卵，分别设置实验组和对照组，进行如下研究：(1)Realtime-PCR观察PKCδ在1-细胞期小鼠受精卵各期中的表达。(2