胰岛素在小鼠受精卵早期发育中的作用

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1、中国科学C辑:生命科学2008年第38卷第10期:956~962《中国科学》杂志社www.scichina.comlife.scichina.comSCIENCEINCHINAPRESS胰岛素在小鼠受精卵早期发育中的作用于秉治,张哲,邓欣,徐小燕,冯晨,李延笑,崔城,宿文辉,赵鸿梅,于大海中国医科大学生物化学与分子生物学教研室,沈阳110001E-mail:ybzbiochem@yeah.net收稿日期:2008-04-15;接受日期:2008-06-06国家自然科学基金(批准号:30570945)资助项目摘要大量研究已经证实生长因子和激素在胚胎早期发育的细胞增殖与分化过程中起

2、着重关键词要的作用.应用定量ELISA,RT-PCR,免疫印迹和免疫荧光的方法检测胰岛素在小鼠受精卵小鼠和卵母细胞中的表达和定位.发现胰岛素均匀分布在卵细胞的胞浆中.同时也检测到mTOR胚胎(mammaliantargetofrapamycin)和p70S6K的表达、活性和定位.在小鼠受精卵中mTOR和胰岛素mTORp70S6K的表达没有明显不同.二者在G1,G2和M期分布在细胞浆,在S期聚集在原核的周S6K围.在不同时期,mTOR的活性是波动的.利用PI3K的特异性抑制剂渥曼青霉素,观察到卵裂率明显减低.当使用mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素时,受精卵的第一次有丝分裂延迟.这些

3、结果表明胰岛素存在于小鼠的卵母细胞和受精卵中,并且胰岛素可能通过激活PI3K/PKB/mTOR/S6K的信号传导通路在小鼠的早期胚胎发育中发挥功能作用.胰岛素是一种由胰腺的β细胞合成与分泌,在糖有检测到胰岛素.在研究小鼠的受精卵的早期发育代谢调节和新陈代谢的途径中发挥重要调控作用的中,本实验组发现了一些胰岛素的下游效应因子,如[1]激素.胰岛素通过与受体结合而发挥作用,已经证mTOR和S6K,在小鼠的受精卵中表达,具有活性,实胰岛素可能在哺乳动物的早期发育阶段中对新陈并发挥着重要的作用.既然PI3K/PKB/mTOR/S6K[2]代谢、细胞增殖、分化发挥重要的作用,包括母源途径

4、需要胰岛素信号的刺激才能被激活,那么受精的(如insulin)和胚胎源的(如IGF-Ⅱ)因子都可能调卵当中是否存在PI3K/PKB/mTOR/S6K的上游信号节其早期阶段的发育[3].有研究[4~6]显示PI3K-分子——胰岛素,我们认为有必要对胰岛素及其受体PKB-mTOR与胰岛素下游信号传导通路相关.mTOR在小鼠卵母细胞和受精卵中是否表达进行检测.[7]是一个磷脂酰肌醇激酶-相关激酶家族的成员并且1材料和方法在细胞生长中起关键作用.胰岛素可以激活mTOR,1.1小鼠胚胎的收集和培养激活的mTOR通过它的下游效应因子核糖体40S亚单位蛋白S6激酶1(S6K1)和eIF起始因

5、子4E结合4~6周龄成熟雌性昆明系小鼠(由中国医科大学蛋白1(4EBP1)调节蛋白质合成.mTOR通路的完全实验动物部提供),经严格明暗循环喂养4天后,腹腔活化需要来自营养(如氨基酸与葡萄糖)和生长因子注射孕马血清促性腺激素10IU(PMSG,天津市华孚(如胰岛素)的双重作用,并能促进细胞生长和抑制凋高新生物技术公司),46~48h后腹腔注射绒毛膜促性亡.腺激素10IU(hCG,上海生物化学制药厂),将注射[3]hCG的雌鼠分别与分开饲养的8周龄以上成熟雄性早期研究曾报道在小鼠的1-细胞期胚胎中没956中国科学C辑:生命科学2008年第38卷第10期昆明系小鼠合笼过夜,次日清晨

6、检查雌鼠阴栓,有阴底片经凝胶成像分析系统进行扫描成像.栓者为交配成功,注射hCG后16~19h脱颈椎处死雌1.4mTOR激酶活性测定鼠,取双侧输卵管,实体镜下于M2培养液(购自mTOR在小鼠1-细胞胚胎中激酶的活性用文Sigma公司)中撕开壶腹膨大处,使受精卵自然流出,献[10~12]中的方法检测.50个小鼠的1-细胞胚胎用透明质酸酶除颗粒细胞,移入M16培养液(购自裂解缓冲液(20mmol/LTris-HCl,pH7.5,含1%Sigma公司)中,于37℃,5％CO2条件下培养相应时NP-40,1mmol/LEGTA,1mmol/LEDTA)4℃裂解.间后,收集G1,S,G2

7、以及M期受精卵.激酶的活性用4-EBP1作底物分析,在一个反应混合1.2RT-PCR液中包括(20mmol/LTris-HCl(pH7.5),75mmol/LNaCl,10mmol/LMgCl2,1mmol/LDTT,20μmol/L将收集到的各期受精卵(每期300个),以Quick-32ATP,5μCi[γ-P]ATP)20μL的体积中分析,反应进PrepMicromRNAPurification试剂盒(购自Amersham行30min,在30℃条件下,取25μL反应液点于Bioscien