第6章 分子生物学技术

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1、第六章分子生物学基本操作技术第一节核酸的提取第二节核酸杂交技术第三节PCR技术第一节核酸的提取一、提取核酸的基本步骤（一）总则保证核酸一级结构的完整性；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；应尽量去除非目标核酸分子。（二）措施①温度不要过高；②控制pH值范围(pH值5-9)；③保持一定离子强度；④减少物理因素对核酸的机械剪切力；⑤所用器械和一些试剂需高温灭菌；⑥提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。（三）核酸分子抽提的技术

2、设计1、核酸的释放--破裂细胞，释放核酸。⑴高速组织捣碎机捣碎⑵玻璃匀浆器匀浆⑶超声波处理法⑷液氮研磨法⑸化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）⑹生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2、核酸的分离与纯化将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非目的核酸分子、试剂3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤4、核酸的鉴定⑴浓度鉴定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液--紫外分光光度法。DNARNA浓度(μg/

3、ml)=OD260×稀释倍数×5040低浓度核酸溶液--溴化乙锭荧光光度法。⑵纯度鉴定DNA:OD260/OD280=1.8；OD260/OD230>2.0。RNA:OD260/OD280=1.7-2.0；OD260/OD230>2.0。⑶完整性鉴定--凝胶电泳法5、核酸的储存DNA：①溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）缓冲液中，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。RNA：①溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20℃保存。或加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核

4、苷复合物)冻贮于-70℃。二、基因组DNA的分离与纯化（一）样品准备常见的标本：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞、细菌等。生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存－70℃或液氮中。（二）DNA提取1、酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。主要试剂及其作用：EDTA：①二价金属螯合剂，抑制核酸酶；②降低细胞膜的稳定性。SDS：①溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜破裂；②溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；③对RNA、DNA酶有抑制作用；

5、④与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。蛋白酶K：消化DNA酶和细胞中的蛋白质。可与SDS、EDTA同时使用，仍保持较高活性。酚：使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性。pH8.0的Tris溶液：使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。酚或酚-氯仿中少许的异戊醇：减少气泡的产生，利于分相，保持分相的稳定性。2甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤。适用于从标本中制备高分子量的DNA样品--可得200kb左右的DNA。3玻璃棒缠绕法：用盐酸

6、胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。4异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。5表面活性剂快速制备法：用TritonX-100或NP-40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。（三）DNA样品的纯化方法：透析、层析、电泳及选择性沉淀。琼脂糖电泳适用于0.1-60Kb片段，聚丙烯酰胺（PAGE）电泳适用于5-500bp大小的片段。琼脂糖含量％（W/V）线性DNA分离范围（Kb）0.35-600.61-200.70.8-

7、100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2（四）DNA的浓缩1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。（六）DNA回收主要是从电泳中分离回收DNA片段。回收原则：尽量提高回收率，去除回收DNA样品中的污染物。电泳到DEAE-纤维素膜：500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。透析袋电洗脱：低熔点琼脂糖凝胶：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解