第03章 分子生物学实验基本操作技术

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1、第3章分子生物学实验基本操作技术这里的实验基本操作技术是指在分子生物学实验中使用范围最广、使用频率最高、几乎所有实验都要应用的技术。器皿的清洗，试管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、电子天平等量具的正确操作和使用、试剂配制等技术，应当都是基本操作技术，但这些内容已在分析化学、生物化学的实验课程中作了详细介绍。本章主要介绍与分子生物学实验有关的除（灭）菌技术、无菌操作技术和微量操作技术。3.1除(灭)菌技术在进行分子生物学实验过程中，需要一个清洁的实验环境，所使用的器皿及溶液均需要进行除（灭）菌处理，一方面避

2、免环境中微生物的污染，另一方面还可消除蛋白酶和核酸酶对实验的干扰和影响。在进行微生物及细胞的纯培养时要求更高，不能有任何外来杂菌。因此，对所有器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，保证工作顺利进行。实验室常用的除灭菌方法主要有物理方法及化学方法两种。物理方法包括用湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线、过滤、离心沉淀等方法除去微生物；化学方法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀死或抑制微生物。根据被灭菌物品的材料性质和实验要求，可采取不同的消毒灭菌方法。3.1.1物理灭菌法（1）干热灭菌：干热灭菌包括火焰灼烧灭菌和

3、热空气灭菌。火焰灼烧适用于金属用具，如接种环、接种针和手术器械等，玻璃器皿的口颈，如试管口和瓶口，玻璃棒等的灭菌处理。这种方法灭菌迅速彻底。热空气灭菌一般在烤箱中进行，利用高温干燥空气（160℃~170℃）加热灭菌1~2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。干热消毒后的器皿干燥，易于保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要求较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的。应当注意，干烤灭菌完毕后不得马上将烤箱门打开，须等温度降至70℃以下时再开箱门，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事

4、故。在灭菌时，物品不能放的太挤。灭菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌时容易炸裂。培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此方法消毒。（2）湿热灭菌：在相同温度下，湿热的灭菌效力比干热灭菌好。原因是：（1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；（2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更有效地杀灭微生物；（3）蒸汽存在潜能，当气体转变成液体

5、时可放出大量热能，故可更迅速提高灭菌物体的温度。湿热灭菌常用的方法有高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌和煮沸灭菌。其中高压蒸汽灭菌法最为常用，效果最好。常压蒸汽灭菌法不能在短时间内杀死细菌芽孢，必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，才能达到完全灭菌。而煮沸灭菌仅用于注射器及某些用具的灭菌，被灭菌物品的湿度太大。所以，这两种方法较少使用。高压蒸气灭菌是在密闭的高压蒸汽锅中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，将锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热就会使锅内的蒸汽

6、压逐渐上升，从而使温度也随之上升到100℃以上。灭菌时，根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15MPa下15min，培养液和橡胶制品为0.1MPa下10min。灭菌前在锅内加适量的水，加水过少，易将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物品浸水。物品不能装得过满，以免影响消毒器内气体流通。导气管要伸至罐底并防止堵塞。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，开始升压，当达到所需压力时

7、，开始计时，并控制压力恒定。灭菌过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止意外事件发生。灭菌完毕后一定要先打开阀门放气，当灭菌锅内压力下降到“0”时，再打开灭菌锅的盖。也可在灭菌完毕后，关闭电源总阀，让灭菌物品自然冷却，待灭菌锅压力表降至“0”时，再取出灭菌物品。蒸汽压力与温度的关系蒸汽压力（表压）蒸汽温度Kg/cm2MPa℃℉0.000.001002120.250.025107.02240.500.050112.02340.750.075115.52401.000.100121.02501.

8、500.150128.02622.000.200134.5274（3）紫外线杀菌：紫外线的波长范围是200~300nm，杀菌范围为240~280nm，其中波长在260nm左右的紫外线杀菌作用最强。紫外灯是人工制造的低压水银灯，能辐射出257.3nm的紫外线，杀菌能力强且较稳定。紫外线杀菌作用是因为它可以被蛋白质（波长为280nm）和核酸（波长为260nm）吸收，造成这些分子的变性失活。紫外线穿透能力