分子生物学技术

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1、第十三章分子生物学技术第一节、重组DNA技术-基因工程第二节、分子杂交及相关技术第三节、聚合酶链反应的原理和应用第四节、基因定位的常用方法1分子生物学技术70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。2194619501955196019651970197519801985199019951944DNA是遗传物质1949Hbs贫血1953双螺旋1956Hbs

2、Glu-Val1966遗传密码第一个R酶1972重组质粒1975DNA杂交1977DNA测序1981转G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一个基因治疗1995细菌G组序列1996酵母基因组序列现代分子遗传学发展重要事件3第一节重组DNA技术-基因工程重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技术。重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）是人类根据需要选择目的基因（

3、DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。4一、限制酶限制性内切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。51、限制酶的命名根据其来源命名。如：属名菌株名EcoRI种名编号EcoRI来源于大肠

4、杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。62、限制酶识别序列和切割形成每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。如：HareⅢ5’-GGCC-3’BamHI5’-GGATCC-3`平末端(bluntend)对称轴切，连接效果差切割形成粘性末端（stickyend）交错切。78部分常用限制酶及切点9互补末端连接10产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：1)用同一种限制酶切割；2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端

5、的限制酶切割。113、特点：根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：1)不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。2)用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。3)Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。12二、基因运载体及其选择载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。13载体具以下特征：1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主

6、细胞并在其中增殖；2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。14（一）.质粒plasmidPlasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。PBR322大肠杆菌pSC101PlasmidchromosomeCOIEIplasmid革兰氏阴性菌pc194scp12真核生物-酵母质粒15常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。

7、将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。EcoRIHindIIIOri复制起点LacZAPRpUC1916（二）.λ-噬菌体(λphage)是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克

8、隆载体，如：171、置换λ载体–溶解途径载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。2、插入λ载体–裂解途径DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。18裂解途径19（三）.粘粒(cosmidvector)（30～40kb）是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasm