第6章 常用分子生物学技术原理

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1、第六章常用分子生物学技术原理第一节重组DNA技术重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(c

2、loning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。(二)工具酶工具酶的概念是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针、载体构建、目的基因选取、重组体DNA制备等程序中所需要的酶类。核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶，

3、作用于磷酸二酯键的P-O位置。根据核酸底物：分为DNA酶、RNA酶。根据对底物作用方式：分为核酸内切酶和核酸外切酶。核酸内切酶：指能从核酸分子内部切割磷酸二酯键。核酸外切酶：指能从核酸分子末端开始一个一个切割下核苷酸的酶。5核酸外切酶：从端切除核苷酸的核酸外切酶。5核酸外切酶：从5端切除核苷酸的核酸外切酶。重组DNA技术中常用的工具酶限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用：与甲基化酶共同构成细

4、菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。1、限制性核酸内切酶分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（基因工程技术中常用的是Ⅱ类）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。2、命名原则：HindⅢ属种株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶3、Ⅱ类酶识别序列特点：——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG4、大部分Ⅱ型限制性内切核酸酶反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH

5、7.5MgCl210mmol/LNaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μLTemperature37℃Time1-1.5h◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。5.同裂酶与同尾酶同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性内切核酸酶识别与切割相同的核苷酸靶序列,但切点不同,这类酶称为同裂酶。SmaI和XmaI(CCCGGG)。同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性内切核酸酶识别与切割的核苷酸

6、靶序列各不相同，但能产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。碱性磷酸酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）（三）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准能自主复

7、制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。质粒载体质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的基因载体，主要用于原核生物和真核生物的基因转移及建立基因组文库和cDNA文库。1.质粒(plasmid)的概念：独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。质粒分子成份：DNA、RNA。质粒DNA的构型：共价闭合环状(ccc-DNA)、开环(oc-DNA)和线性(l-DNA)构型。Plasmidchromosomeccc

8、2.质粒的生物学特性(1)质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态,但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体地复制而复制。(2)质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在