欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:18761670
大小:2.84 MB
页数:63页
时间:2018-09-22
《常用分子生物学技术的原理及应用课件》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、1第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication2第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology3核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中,如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中,或把DNA与RNA放在一起,只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduple
2、x)。一、分子杂交与印迹技术的原理4复性RNADNA5(一)印渍技术Blotting首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印渍”,指将存在于凝胶中的生物大分子转移(印渍)到固定化介质是病加以检测分析的技术,目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测6探针技术probe将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记,称为“探针”然后用于分子杂交,杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术,使杂交区带显现出来7二、印渍技术的类别及应用DNA印迹技术Southernblo
3、ttingRNA印迹技术Northernblotting蛋白质印迹技术Westernblotting斑点印迹Dotblotting原位杂交insituhybridizationDNA点阵DNAarrayDNA芯片技术DNAchip8(一)DNA印迹技术Southernblotting又称为Southern杂交,即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术,主要用于基因组DNA的分析,如在基因组中特异基因的定位及检测等,亦可用于分析重组质粒和噬菌体。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。9基本方法将DNA标本用
4、限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段;经碱变性,Tris缓冲液中和,高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上,烘干固定,凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置,确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。10PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心11(二)RNA印渍技术Northernblotting又称为No
5、rthern杂交,即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。12(三)蛋白质印渍技术Westernblotting又称为Western杂交,或免疫印渍技术,即利用抗原-抗体反应,检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用:用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。13三种印迹技术的比较14(一)DNA印迹技术(Southernblotting)用
6、于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。(二)RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。(三)蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。15斑点印迹Dotblotting斑点杂交法是不经过电泳,而将被检标本直接点到膜上,烘烤固定,用于杂交。这种方法耗时短,可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品。16原位杂交insituhybridization即组织原位杂交,指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RN
7、A杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置,这一点具有重要的生物学和病理学意义。17第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction18PCR技术polymerasechainreactionPCR即聚合酶链反应技术,是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用,通过变性-延伸-复性的循环操作,在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍,从而大大提高对其进行分析研究的速度。195Primer15Primer2Cycle2Cycle1555
8、555TemplateDNA55555555一、基本工作原理20Cycle3555555555555555525~30次循环后,模板DNA的含量可以扩大
此文档下载收益归作者所有