常用分子生物学技术的原理及应用课件

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1、1第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication2第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology3核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduple

2、x)。一、分子杂交与印迹技术的原理4复性RNADNA5（一）印渍技术Blotting首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测6探针技术probe将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来7二、印渍技术的类别及应用DNA印迹技术Southernblo

3、ttingRNA印迹技术Northernblotting蛋白质印迹技术Westernblotting斑点印迹Dotblotting原位杂交insituhybridizationDNA点阵DNAarrayDNA芯片技术DNAchip8（一）DNA印迹技术Southernblotting又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。9基本方法将DNA标本用

4、限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。10PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心11（二）RNA印渍技术Northernblotting又称为No

5、rthern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。12（三）蛋白质印渍技术Westernblotting又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。13三种印迹技术的比较14（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用

6、于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。15斑点印迹Dotblotting斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。16原位杂交insituhybridization即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RN

7、A杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。17第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction18PCR技术polymerasechainreactionPCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。195Primer15Primer2Cycle2Cycle1555

8、555TemplateDNA55555555一、基本工作原理20Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大