分子生物学教学资料第9章-分子生物学技术

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1、技术原理步骤应用NucleicacidsTechniques电泳分离DNA,RNA带负电，朝正极移动大DNA比小DNA跑得慢supercoiled（超螺旋）〉linear（线性）＞nickedorrelaxed（缺刻或松散）乙二醛防止RNA碱基配对脉冲Pulsed・field电泳PFGE染色剂：ethidiumbromide（EB,漠化乙锭）Gelmatrix（胶支持物）:Polyacrylamide（聚丙烯酰胺）•分辨力高,size范围小Agarose（琼脂糖）■分辨力低，size范围大resolvingcapability两个方向的轮流电流-DNA越大跑

2、得越慢根据分子量大小，形状，拓扑结构分离DNA和RNA限制性内切酶（RE）切割技术内切酶：使大DNA分子打断成易管理的片段限制性内切酶：特异位点识别短回文结构识别的目标序列、长度、产生的DNA末端不同（bluntends-平末端,stickyends•粘性末端）细菌利用甲基化酶修饰基因组防止白身基因被RE降解基因克隆和表达技术[.构建重组DNA分子，通过向合适的载体中插入目的片段（RE,连接酶）2.转化：将重组质粒导入感受态细胞（competentcells）中3.含有同一重组DNA的单个细胞繁殖形成一个克降4.筛选阳性克隆（抗生素，蓝白斑：lacZ-半乳糖

3、昔酶-X-gal■蓝色）载体vector特征：复制起始位点、易于分离、最少一个标记、多克隆位点MCS质粒plasmid：最常用的vector分子杂交技术hybridizationDNAProbe探针：1.放射性标记：32P：S'-polynucleotidekinasePNK.B'-terminaltransferase掺入标记法uniformlylabeling32P-dATP,dCTP,dGTP,dTTP2.抗原标记•抗体结合•酶结合■底物反应Southernhybridization1.DNA样品用RE消化，agar电泳2.DNA探针做标记，变性，附在

4、膜上3.转移印迹（胶膜），目的DNA与探针杂交，X-ray,曝光DNA杂交技术确定复杂的DNA混合物的序列和大小，估计基因数量Westernhybridization蛋白质跑完PAGE后转移至膜上通过抗原抗体反应检测特异蛋白的存在探针：抗体应用：蛋白质大小和数量，测定基因表达水平Northernhybridization以上DNA样品换成mRNA样品，无需酶切消化RNA杂交技术确定复杂的RNA混合物的序列和大小，测定某基因的表达水平PCR技术（聚合酶链式反应）dNTPprimer:templatejunction正向和反向引物similarG+Cconten

5、ts（Tm）从引物的丁端延伸PPi供能Mg2+模板Denaturation变性95°CAnnealing退火55°CPolymerization（elongation,extension）（延伸）72°C25-35个循环利用DNA目的序列两端的一对引物，在体外扩增DNA序列其他PCR：反向PCRRT-PCR：检测基因转录量mRNA・>cDNA・>DNA半定量RT-PCR（目的基因的转录量/管家基因的转录量）ProteinTechniquesProteinpurification（蛋白质纯化）柱层析Columnchromatography玻璃柱子、被修饰过的小

6、丙烯酰胺或琼脂糖珠子根据蛋白质的大小，电荷，性状，功能分离纯化离子交换层析Ionexchangechromatography根据表面电荷分离蛋白珠子带上正/负电化学基团凝胶过滤层析Gelfiltrationchromatography根据分子大小和形状分离蛋白珠子有大小不同的孔，小蛋白进入空内导致跑得慢，大蛋白直接通过亲和层析纯化目的蛋白已知可以和某种特异分子有高亲和性或特异性的反应将这种目的蛋白的特异partner偶联到柱子上。Immunoaffinitychromatography（免疫亲和层析卜抗体有利于加速蛋白质的纯化PAGEgel蛋白质分离，Wes

7、ternanalysis免疫印迹SDS变性蛋白质使形状一致mercaptoethanol（蔬基乙醇）打断二硫键stain着色：Coomassiebrilliantblue（考马氏亮蓝）TechniquesforstudyingDNA-proteininteractionDNA・蛋白亲和层析生物素标记DNA->结合到链亲和素磁珠上・>纯化蛋白->SDS-PAGE纯化及蛋白质测序得到与已知DNA相互反应的蛋白质Gelretardation（凝胶阻滞）电泳迁移率变动分析ElectrophoreticMobilityShiftAssay>EMSADNA与蛋白质结合后

8、跑得比较慢竞争性EMSA：①标记特异DNA+蛋白质②