实验九new微丝的观察-鬼笔环肽标记

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1、实验九动物细胞内微丝结构的观察（鬼笔环肽标记法）实验目的1.了解鬼笔环肽标记微丝结构的原理。2观察微丝束（应力纤维）在动物细胞内的分布。3学习细胞固定，穿透，染色等技术。4巩固荧光显微镜的使用技术。实验原理Actin-TrackerGreen是一种Actin绿色荧光探针，可以用于培养细胞或组织切片的Actin特异性荧光染色。?Actin-TrackerGreen探针为荧光染料FITC标记的毒蕈肽(phalloidin)，即phalloidin-FITC，其分子量约为1251.4，最大激发波长为496nm，最大发射波长为516nm。可以用于细胞或组织内的微丝(microfilamen

2、t)的荧光检测。?使用时的推荐稀释比例为1:200。如果每个片子需要使用200μl染色工作液，每个包装的本产品足够用于200个片子的染色。主要仪器与溶液主要仪器荧光显微镜、移液器（1000ul和100ul)材料：细胞爬片，两人一孔。溶液PBS配制的3.7%甲醛溶液。0.1%TritonX-100的PBS洗涤液含有5%BSA和0.1%TritonX-100的PBS按照1:200的比例稀释Actin-TrackerGreen实验步骤a用PBS洗涤细胞或组织切片2次。每次0.4ml.b.弃去洗涤液，用PBS配制的3.7%甲醛溶液室温固定细胞或组织切片约10分钟。注意：甲醇可以破坏acti

3、n蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。并且尽量使用不含甲醇的甲醛。每孔0.2ml.c.弃去固定液，用含0.1%TritonX-100的PBS洗涤2-4次，每次约5分钟。每次0.2ml.d弃去洗涤液，把Actin-trackerGreen染色工作液按照每个片子约100μl的比例滴加到片子上，室温避光孵育30分钟。实验步骤e.用含0.1%TritonX-100的PBS洗2-4次，每次约5分钟。每次200ul。f.在载玻片上加一滴PBS,反扣盖玻片（生长有细胞的一面朝下），随后可以用荧光显微镜进行观察。为长期保存，可以在片子自然干燥后封片并于4℃避光保存，保存时间可长达6个月左右。实验结

4、果荧光显微镜激光共聚焦显微镜显示的细胞中的微丝分布作业1为什么不能使用细胞松弛素B标记微丝结构？2Triton-x100溶液处理细胞的作用是什么？3本实验中能使用甲醇固定细胞吗？为什么？4动物细胞内重组表达的GFP-Actin融合蛋白也能装配成微丝，试设计实验观察GFP-Actin装配形成的微丝结构，拟出实验的标题，原理、目的和实验的步骤。