《基因诊断与治疗》PPT课件

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1、第八章基因诊断与基因治疗第一节基因诊断基因诊断(genediagnosis)是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。一、基因诊断的概念基因诊断的基本原理是检测DNA或RNA的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。临床意义:在于不仅能对疾病作出早期、确切诊断，而且也能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。近年来，随着基因诊断技术的发展和应用，基因诊断的原理和方法不仅适用于遗传性疾病，而且已广泛应用于感染性

2、疾病和肿瘤的诊断以及法医学等领域。1、核酸分子杂交关于核酸分子杂交的基本原理和基本类型前面已讲过。用于基因诊断的核酸分子杂交方法包括：二、基因诊断的技术方法（一）基因诊断中常用的分子生物学技术（1）Southern印迹法是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。（2）Northern印迹法可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。Southern印迹Northern印迹（3）斑点杂交可用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析。优点：方法简单、快速、灵敏、样品用量少；

3、缺点：是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。（4）原位杂交可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断。原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置状况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，也可检出基因和基因产物的亚细胞定位。PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交、限制酶酶谱分析、单链构象多态性检测、限制性片段长度多态性分析、DNA序列测定等联合应用。2、聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)检测是一种基于单链DN

4、A构象差别来检测点突变的方法。3、单链构象多态性检测原理：DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。长度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中表现出不同的迁移率。SSCP常与PCR联合应用，称为PCR-SSCP技术。基因突变可能导致基因上某一限制酶识别位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况

5、。4、限制酶酶谱分析DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。由于PCR技术的应用，使DNA测序技术从过去的分子克隆后测序进入扩增产物直接测序的新阶段。5、DNA序列测定DNA芯片技术是近年来兴起的基因分析与检测的新技术，以其快速、敏感、高效、平行化、自动化等特点，将发展成为新一代基因诊断技术。应用DNA芯片,不仅可以检测基因的结构及其突变、多态性，而且可以对基因的表达情况进行分析，因此在基因诊断中的应用前景非常广阔。6、DNA芯片技术（二）基因诊断的基本方法人类疾病的原因包括内因和外因两大类，内因主

6、要是指遗传因素，即基因结构、表达状况的改变。其中基因结构的改变包括点突变、插入、缺失，重排、易位、基因扩增、基因结构多态性变异、前病毒插入等；外因是指外在的环境因素，如病原体的侵入等。因此，针对这些病因可采取相应的基因诊断方法，主要的可从以下几个方面着手：①诊断已知的点突变：对于突变位点已被阐明的一些遗传病，可以采用PCR／ASO(allelespecificoligonucleotide，ASO，等位基因特异性寡核苷酸)探针法进行检测。在扩增DNA片段后直接与相应寡核苷酸探针杂交，即可明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。1、基因突变的诊断（1）点

7、突变的诊断在该位点两端设计引物1、2进行PCR扩增，得到产物后进行斑点杂交或狭缝杂交。针对该突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针（待检测的位点位于最中央）：其中一个为正常探针，与正常序列互补；另一个是突变探针，与突变序列互补。3′突变位点5′引物2引物1寡核苷酸探针中央碱基与被探测的DNA上相应碱基或匹配或错配，对二者结合力影响最大。严格控制杂交及洗脱条件，使只有与靶序列完全互补的探针才能结合在等位基因片段上，而中央碱基与靶序列不匹配的探针则不能结合在等位基因片段上。结果分析：a.如果从受检者DNA扩增的PCR产物只与正常探针杂交，表示受检者不存在这种突变基

8、因；b.如果只有突变探针可以杂交，则说明突变基因是纯