《基因诊断治疗》PPT课件

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1、基因诊断和基因治疗（GenediagnosisandGeneTherapy）1基因诊断概述几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。基因诊断主要内容一、基因诊断概念二、基因诊断常用技术三、基因诊断策略四、基因诊断在临床的应用1.在遗传性疾病诊断中的应用2.在传染性疾病诊断中的应用3.在肿瘤诊断中的应用4.在法医学上的应用五、基因诊断存在的问题和发展前景4基因诊断的出现：1976年加州大学华裔科学家

2、KanYW用核酸分子杂交首次对一例α珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断。狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。基因诊断的概念核酸分子杂交技术PCR及其衍生技术限制性酶谱分析限制性片段长度多态性分析寡核苷酸探针杂交DNA芯片技术DNA测序技术二、基因诊断中常用的几种技术(一)核酸分子杂交技术(1)方法:以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的

3、目的核酸链进行定性、定量分析.(2)几种不同形式的核酸分子杂交a.Southern印迹(southernblot)杂交:用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等．b.Northern印迹(Northernblot)杂交:用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析．c.斑点杂交（dotblot):既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析．方法简单、灵敏；但特异性低．d.原位杂交（insituhybridization):是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术．可分为DNA原位

4、杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断．分类:①玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片.②膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜)原位杂交的镜像图(二)PCR技术在基因诊断中的应用（１）等位基因特异性寡聚核苷酸（allelespecificoligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针．在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交．杂交的结果有如下几种情况：①PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交—不存在

5、这种突变；②只与突变探针杂交--突变基因为纯合子；③与正常探针和突变探针都可杂交--突变基因为杂合子；④与正常探针和突变探针都不能杂交--突变基因不属于已发现的类型ASO探针杂交检测已知点突变受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交ASO1ASO2NormalHeteroHomo（２）PCR-单链构象多态性（PCRsinglestrandconformationploymorphism,PCR-SSCP)分析是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法．DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同

6、,形成的构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE电泳中表现出不同的迁移率.SSCP特别适于分析小于400bp的PCR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质PCR-SSCP分析原理示意(3)PCR-限制性片段长度多态性（PCRrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,PCR-RFLP）分析基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因

7、组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.限制性片段长度多态性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)样品一样品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率