基因诊断与基因治疗ppt课件.ppt

《基因诊断与基因治疗ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、疾病的基因诊断技术吴兴泉一、基因诊断（一）、基因诊断的对象1、病原生物的侵入常用方法：显微镜及免疫学方法。基因诊断的优势：高敏感性。高特异性。在无法得到商业化抗体时，基因诊断就成为唯一手段。目前，基因诊断已在病毒性肝炎，受滋病等传染病的诊断中发挥了不可代替的作用。2、先天遗传性疾患基因突变所致遗传病。诊断方法常规方法：分析临床症状及生化检查。基因诊断：检测突变基因，确定发病原因。病因不明的疾病：如高血压、自身免疫性疾病等，可能是某些基因的改变造成。因此基因诊断不仅对临床诊断，而且对疾病的病因和发病机理的研究

2、都具有重要的意义。3、后天基因突变引起的疾病最典型的例子就是肿瘤。肿瘤的发病机理尚未完全明了，但人们可以初步认为肿瘤的发生是由于个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖。无论是抑癌基因发生突变还是癌基因发生突变，如果确定这些改变的发生，都必须进行基因诊断。4、其它方面：如个体识别，亲子关系识别，法医物证等。（二）、基因诊断的方法可致疾病的遗传背景改变主要有两类：1、遗传物质即DNA或RNA的水平的变化。例如病毒感染后其基因及其转录产物在人体内的从无到有，癌基因表达水平的从低到高。2、遗传物质的结构变化即基因突变

3、，如点突变引起的基因失活，及染色体转位引起的基因激活或灭活等等。基因诊断的方法：从理论上说所有检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断。但如考虑其临床适用性，灵敏度等问题，下列两种方法可看作是有应用前景的基因诊断的方法：1、核酸杂交2、聚合酶链反应1、核酸杂交核酸杂交：原理是核酸变性和复性理论，即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为：DNA印迹杂交(Southernblothy

4、bridization)RNA印迹杂交(Northernblothybridization)。核酸杂交的步骤：（1）制备样品：则可直接在变性条件下电泳分离，从待检测组织样品提取DNA或RNA。用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离，凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理转印到支持膜上并使其牢固结合。RNA样品然后转印并交联固定。玻璃板干燥滤纸硝酸纤维素膜酶切电泳电泳后凝胶电泳缓冲液显色缓冲液浸湿的滤纸紫外交联杂交（2）制备探针探针是指一段能和待检测核酸

5、分子按照碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA或RNA。探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。通过检测膜上的核酸分子结合上的探针分子，就可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，及其在电泳凝胶上的位置，就知道了它的分子大小。标记物：放射性标记物：32P、3H、35S非放射性标记物：生物素、地高辛(dig)（3）杂交首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。变性标记好的探针让探针与膜在特定的温度下反应洗去未结合的探针分子。（4）检测检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标

6、记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。地高辛(dig)标记探针的检测。BCIP/NBT紫蓝色沉淀抗地高辛抗体碱性磷酸酶地高辛连接臂待检测DNA探针2、聚合酶链反应：（polymerasechainreaction,PCR）在同一试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段的合成。DNA可直接用于PCR反应。RNA要反转录成为cDNA，再进行PCR反应。PCR的基本原理TwoprimersABFreenucl

7、eotidesTaqDNApolymeraseMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+BuffercontainingmagnesiumTargetDNA5’3’3’5’Thebasicprotocol--denaturationTargetDNA95oC5’3’3’5’5’3’3’5’Thebasicprotocol--annealing~55oC5’5’ABprimersAB5’3’3’5’Thebasicprotocol--extension72oC5’5’Taqpolymerase3’5’5

8、’3’Thebasicprotocol--extension72oC5’5’5’3’3’5’3’3’Attheendofthefirstcycle5’5’5’3’3’5’3’3’95oC5’5’3’3’5’3’denaturation5’3’5’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’55oCannealing5’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72oCextension5’5’5’3’3’5’3