微生物的分离纯化

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1、微生物的纯化分离方法白然界屮的微生物几乎都是混杂在一•起的。分离和纯化的H的是从各种样品来源混杂的微牛•物群体中获得纯种微生物，即在一定的条件下培养、繁殖得到只有一种微生物的培养物（也称为纯培养物），要找出化妆品生产各环节造成微牛物污染的原因，明确污染菌的数量和组成，了解污染菌的生理生化特性，首先必须进行样品中微生物的分离纯化技术。一、实验冃的1.掌握常用微生物分离纯化方法2.了解样品的预处理方法二、实验原理将样品进行一定的稀释，使得每一个细胞尽量能够单独分散存在，通过适当的方法将某个细胞挑选岀來，这个细胞就成为纯种。常用菌种分离纯化的方法有稀释混合倒平板法

2、、稀释涂布平板法、平板划线分离法、亨盖特稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法和选样培养分离法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备，分离纯化效來好。三、实验材料1.含菌样品2.培养基：营养琼脂培养基3.培养1111、接种针、涂布棒、试管、移液管、天平、三角瓶、称量纸四、实验方法与步骤1.稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中，冷却凝固而成的盛冇固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品用无菌生理盐水作一系列的稀释（常用10倍稀释法，稀释倍数要适当），然后分别取不同稀释液少许（0.5〜ImL）于无菌培养1111屮，倾人己熔

3、化并冷却至50°C左右的琼脂培养基，迅速旋摇，充分混匀。待琼脂凝固后，即成为可能含菌的琼脂平板于恒温箱中倒置培养一定时间后，在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由1个细胞繁殖形成的。挑取单个菌落，一般再垂复该法1〜2次，结合显微镜检测个体形态特征，便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀，取样最和稀释倍数准确，则该法还可用于活菌数测定。稀釋混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间，缺乏溶氧而纶长受影响，形成的菌落微小难以挑取，二是在倾入熔化琼脂培养基吋，若温度控制过髙，易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼

4、脂A快凝固，不能充分混匀。2、稀释涂布平板法稀释涂布平板法是将已熔化并冷却至约50°C（减少冷凝水）的琼脂培养基，先倒入无菌培养血中，制成无菌平板。待充分冷却凝固后，将一定量（约0.1mL或0.2mL）的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表而，再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面,倒置温箱培养后挑取单个菌落。玻璃涂棒连续涂布分离法是一种简单快速有效的涂布平板法，可省去含菌样品悬液的稀释，直接吸取经振荡分散的样品悬浮液1滴加人1号琼脂平板上，用一支三角形无菌玻璃涂林均匀涂布，用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板（连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平

5、板数视样品浓度而定），翻转此涂棒再涂布5号、6号平板，经适温倒置培养后挑取单个菌落。玻踽涂核稀释涂布平板法3、平板划线分离法先制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝崗后，用接种坏以无菌醮取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面有规则地划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其他形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1〜2次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。划线操作示慮图(•)0>

6、)划线轨迹图平板划线分离法1.菌落形态观察平板分离获得的单菌落町以用肉眼观察,必要时对用放大镜检查。不同的菌落特征不同,描述平板上的菌落叮从以下几个方面进行。形状丝状不建則權状為度边缘点状圆形紡傅形製片状波形缺刻状（1）菌落大小:用格尺测量菌落的直径。大菌落（5mm以上）、中等菌落（3〜5mm）、小菌落（l~2mm）、露滴状菌落（1mm以下）。(2)表面形状:分光滑.皱褶.颗粒状.龟裂状、同心环状等。(3)凸起情况:分扩展、扁平、低凸起、凸起、高凸起、台状.草帽状.脐状.乳头状等。(4)边缘状况:分整齐、波浪状.裂叶状、齿轮状.锯齿形等。(5)菌落形状:分圆

7、形.放射状.假根状.不规则状等。（6）表而光泽：分闪光、金属光泽、无光泽等。五、实验注意事项1.样品应做好预处理，选择合适的稀释度。1.取样时，每取一个稀释度，无菌吸管应更换一次。划线时应注意勿将培养基划破。六、思考题1•比较划线分离法与涂布稀释分离法的优缺点？1.在平板划线过程中，为什么每划完一个区后要将接种坏上的残超菌烧公？2.为何平板培养物采用倒置培养方式？