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1、(一)常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备,分离纯化效果好,现分别简述如下 1.稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中,冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品,用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法,稀释倍数要适当),然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中,倾入已熔化并冷却至50℃左右
2、的琼脂培养基,迅速旋摇,充分混匀。待琼脂凝固后,即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后,在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。挑取单一个菌落,一般再重复该法1-2次,结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。图4混合倒平板操作法示意图 图5涂布平板操作法示意图2.稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响
3、,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固,不能充分混匀。 在微生物学研究中,更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基,先倒入无菌培养皿中,制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面,倒置温箱培养后挑取单个菌落。 另一种简单快速有效的涂布平板法,可省去含菌样品悬液的稀释,直接吸取经振荡分散的样品
4、悬浮液l滴加入1号琼脂平板上,用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布,用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定),翻转此涂棒再涂布5号、6号平板,经适温倒置培养后挑取单个菌落。该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。3.平板划线分离法 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来。
5、经培养后,可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1-2次,并结合显微镜检测个体形态特征,才可获得真正的纯培养物。该法的特点是简便快速。 图6平板划线分离操作法示意图 个体细胞的生长难以测定,而且生长与繁殖是交替进行的,因此，微生物的生长繁殖一般不是依据个体细胞的大小,而是以群体细胞数目的增加作为指标的。测定微生物细胞数量的方法很多,主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大可能数(MPN)法、膜过滤法等。 测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直
6、接进行计数的方法,该计数方法被广泛应用于酒精、啤酒和白酒等的工业化生产中。 平板菌落计数法被广泛应用于食品、饮品、水质和活菌制剂等的含菌指数或污染程度的检测。该计数方法又称平板活菌计数法,其最大优点是可以获得活菌数的信息。但是,该计数法操作过程较繁,需要培养一定时间才有结果,且测定结果易受多种因素的影响。 光电比浊计数法是采用光电比色计或分光光度计,测定菌悬液的光密度或透光度,其优点是简便迅速,可以连续测定,适合于自动控制。但该法除了受菌体浓度影响外,还受细胞形态、大小、培养液成分及所采用光波长等因索的影响。(一)显微镜
7、直接计数法 该法是将酵母菌或霉菌孢子悬液,放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下直接进行计数，是一种常用的微生物计数方法。 Thoma血球计数板是一块特制的厚载玻片,玻片的中间部分刻有四条沟槽,形成三个平台。中间的平台较宽且比两边的平台略低,其中央刻有一小方格网的计数区,计数区的面积为l平方毫米。另一种计数器中间平台的中间又被一短的横沟槽分为两半,成为两个小平台,每个小平台上面各刻有一个计数区,共有两个计数区。当盖上特定盖玻片时,盖玻片与计数室的空间厚度正好是0.l毫米,这样计数室的体积为0.l立方毫米,即0.000
8、l毫升。计数室有两种刻度形式,一种是全区分16大格,每大格再分25小格,一共400小格。另一种是全区分25大格,每大格再分16小格,也是400小格。 计数时,可将酵母菌液(或孢子悬液)
