微生物的分离与纯化

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1、实验一、微生物的分离与纯化一、培养基的制备与灭菌1.牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）2.高氏1号培养基（放线菌）3.马丁氏培养基（真菌）二、土壤微生物的分离、纯化实验目的1、熟悉培养基制作原理；2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具体操作方法；4、了解土壤微生物的分离纯化的基本原理；5、学习并掌握微生物分离纯化技术方法。一、培养基的制备与灭菌培养基是人工配制的微生物生活环境，其主要用途是繁殖及分离接种微生物，传代或保存微生物，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养成分包括

2、微生物生长所需要的水分、碳源、氮源、无机盐及某些生长因子（维生素、辅酶）等。二、实验原理1、满足微生物生长培养所需的营养要素：碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子等2、合适PH值3、抑制其它微生物生长的物质。分类主要用于增菌用于检测动力及保存菌种用于分离鉴定细菌分类三糖铁培养基SS培养基普通琼脂培养基血液琼脂培养基庖肉培养基培养基的制备程序1、调配过滤矫正pH（7.0-7.6）分装过滤灭菌（121.3℃，20-30分钟）鉴定是否有菌放入冰箱冷藏备用2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高3、鉴定是否有菌可将培养基置于37℃培养24小时，然后观察

3、干燥箱细菌过滤器用于滤过除菌的各式滤器手提式灭菌锅坐式灭菌锅高压蒸汽灭菌器卧式灭菌锅三、实验器材1、试剂：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、NaCl、PH试纸、琼脂、葡萄糖、孟加拉红、FeSO4·7H20、MgSO4·7H20、KNO3、K2PO3·3H202.仪器及其它试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠四、实验方法和步骤1、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作培养皿的包装每10套一包，用旧报纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。吸管的包装首

4、先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。三角瓶的包扎1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备（1）计算（2）称量准确称取各种成分。（3）溶解向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。（4）调pH值用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。（5）分装根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1）（6）包扎试管扎成捆。（7）灭菌高压蒸汽灭菌15~20min。1、牛肉

5、膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏3.0g、蛋白胨10g、NaCl5.0g、水1000ml、PH7.4-7.62、高氏1号培养基（放线菌）可溶性淀粉20g、NaCl0.5g、琼脂15-20g、FeSO4·7H200.01g、MgSO4·7H200.5g、KNO31g、K2PO4·3H200.5g、水1000ml、PH7.4-7.63、马丁氏培养基（真菌）KH2PO41g、MgSO4·7H200.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15-20g、水1000ml、PH2.培养基的制备与分装（1）三角瓶固体培养基的制备1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入在瓷缸内。（注意药品

6、称量顺序）2.加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解3.完全溶解后，补充水分，调pH值（不要调过头）4.分装置三角瓶中，注意装液量5.加棉塞，包扎，高压蒸汽灭菌,121℃,0.10Mpa,20min（2）试管斜面固体培养基的制备a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入在瓷缸内。（注意药品称量顺序）b.加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解c.完全溶解后，补充水分，调pH值d.在培养基未融化之前，用10mL移液管快速加入试管内，每根7-8mL，塞上棉塞，包扎，灭菌，灭菌完后摆斜面。3.培养基、无菌水、器皿的灭菌1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌。2.灭菌完毕，将试管

7、培养基搁成斜面。3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。二、土壤微生物的分离、纯化土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。基本原理：是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。实验步骤：1、采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。2、制备土样稀释液吹吸几次混匀另留一管