光滑球拟酵母新霉素抗性株加速葡萄糖代谢

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1、!"卷!期微生物学报&’()!"/’)!#$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,+-.#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!光滑球拟酵母新霉素抗性株加速葡萄糖代谢???，#?"刘立明李华钟李寅陈坚（?江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡#?!$1A）（#华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海#$$#1@）摘要：为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的生产强度，在能量代谢分析的基础上提出了降低*CD合成酶活性、但不影响/*EF氧化的育种策略。

2、通过亚硝基胍诱变，获得一株新霉素抗性突变株/$@，该菌株G?3*CD5-:活性降低A"H、丙酮酸产量高于!%,IJ且单位细胞消耗葡萄糖能力提高1%H。添加双环己基碳二亚胺（EKKE）、叠氮钠（/5/1）、新霉素显著降低出发株G?3*CD5-:活性但不影响突变株G?3*CD5-:活性。突变菌株胞内*CD含量下降#1L@H导致生长速率和最终菌体浓度（为出发菌株的@AH）均低于出发菌株，但葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度分别提高1!H和!#L0H，发酵周期缩短?#9。进一步研究发现，突变株糖酵解途径中关键酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和磷酸甘油醛激酶的活性提高了A1L@H、#%L%

3、H和?!L!H，电子传递链关键酶活性提高?$H。结果表明降低真核微生物G?3*CD5-:活性有效地提高了糖酵解关键酶活性而加速葡萄糖代谢。关键词：光滑球拟酵母，丙酮酸生产，糖酵解，G?3*CD5-:，新霉素抗性中图分类号：M01"文献标识码：*文章编号：$$$?3A#$0（#$$"）$!3$A?@3$!利用生物催化剂（微生物、酶），采用取之不尽、用之不竭的可再生生物质资源大规模生产人类所需的能源、化工、医药、食品及农用原材料的工业生物技术是支撑#?世纪社会［?］可持续发展的战略技术。为了提高微生物利用碳水化合物发酵生产目标代谢产物的生产强度，需要加速碳水化合物中心代谢途

4、径（糖酵解途径）的代谢流量。而微生物细胞对糖质底物（以葡萄糖为例）的代谢速度主要受细胞内能量水［#］平控制（图?）。前期研究表明，光滑球拟酵母中胞内高*CD含量抑制糖酵解关键酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性，在一定程度降［#］低胞内*CD含量能有效地提高糖酵解速度。由电子传递链和*CD合成酶（*CD5-:）构成的氧化磷酸化系统对维持细胞内*CD含量起着关键作用，在前期研究中作者通过选育呼吸缺陷型菌株，降低电子传递链的活性有效地降低了胞内［1］N*CD含量而显著提高了糖酵解速度。但糖酵解所需/*E由于电子传递链的阻断使/*EF无法氧化而短缺，在一定程度上限制了糖酵解速度的进

5、一步提高。理想状态是消弱N以满足酵解途径的需要*CD5-:的活性使/*EF氧化成/*E图!糖酵解途径中的能量代谢而不产生*CD。G6,)?2;:S,=4:.5T’(6-46;,(=8’(=.68U5.9V5=原核生物中，O:;-:;等和P’Q’.5等分别降低大肠杆菌［A］成；3(#’**2""2./’*’"缺失G$G?3*CD5-:突变株也表现出相类（!"#$%&’#$’(#)*’）中FN3*CD5-:和G?3*CD5-:的活性，使胞内［@］似的变化。这些研究表明，降低原核生物中*CD5-:的活性［!，"］*CDI*ED比率下降而加快了葡萄糖消耗速度。同样，能有效降低能

6、量代谢而强化目标代谢产物的生产。降低真NR:Q6;5F降低+)&,-%.(#/%&’01*2/(0’#20中F3*CD5-:@"H的核生物中*CD5-:的活性能否有效地提高糖酵解速度，目前活性，使葡萄糖比消耗速率提高了@$H而加速了谷氨酸的合基金项目：江苏省高等学校研究生创新计划；华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室开放课题；教育部高等学校博士点建设专项资金（#$$!$#0!$$1）"通讯作者。23456(：789:;<-=.+):>+)8;作者简介：刘立明（?0@AB），男，安徽宿松人，博士研究生，从事生化工程研究。23456(：46;,((<-=.+):>+)8

7、;收稿日期：#$$!3?#3#%，修回日期：#$$"3$13#?"+#微生物学报6)%&*()0./(.#."()&7(-()&1,,I，S6H!DI@6!D［"］尚不清楚。已有研究表明，在降低!!"#$%&’()$’，#+;线粒体呼吸链酶复合体的测定［#］［$］*+%,&-./&)%+0($’%,+0’.&$%.%0.1,()$’，23),+0(),(&).#(能量具体操作参见文献［A］进行。代谢的研究中，新霉素有效降低了细胞能量代谢，降低细胞#+<蛋白质含量的测定内能量水平。同时新霉素抗性菌株表现出较低%&’()*活参见文献［+D］进