优化简并引物pcr克隆candida glycerinogenes 3-磷酸甘油脱氢酶基因片段

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第27卷第4期食品与生物技术学报Vo1．27NO．42008年7月JournalofFoodScienceandBi0techn0l0gyJu1．2008文章编号：1673—1689(2008)04—0091-06优化简并引物PCR克隆CandidagtcerinogeneS3一磷酸甘油脱氢酶基因片段陈献忠，饶志明，沈微，诸葛斌，方慧英，王正祥，诸葛健(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)摘要：为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Cand

2、idagzcer加gPPs)克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NADT_3一磷酸甘油脱氢酶基因(ctGPD)，对不同酵母和其他真核生物的NAD一3一磷酸甘油脱氢酶进行比对，分析氨基酸和核苷酸的保守序列，设计了4对简并引物用于扩增C．gzcP0gPPs的NAD。。一3一磷酸甘油脱氢酶(GPD)基因片段，经过优化PCR反应条件，利用其中一对中等简并度的引物扩增出CgGPD基因中约600bp的保守核心片段。DNA序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明，该基因片段与其他酵母的胞浆NAD3磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型

3、的保守区域，并且与安格斯毕赤酵母的GPD基因相似性较高。关键词：PCR；NAD。。依赖3一磷酸甘油脱氢酶；产甘油假丝酵母；克隆；简并引物中图分类号：Q785文献标识码：ACloningofNAD+一DependentGlycerol3一PhosphateDehydr0genaseGeneFragmentfromCandidaglcerinogeneswithDegenerateolig0nucle0idePrimersCHENXian—Zhong，RAoZhi—Ming，SHENWei，ZHUGEBin，FANG

4、Hui—Ying，WANGZheng—Xiang，ZHUGEJian(KeyLabofIndustrialBiotechnology，MinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)Abstract：InSaccharomycescerevisiae，glycerolissynthesizedincytosolbyreductionoftheglycolyticintermediatedihydroxyacetonephosphate(DHAP)to

5、glycerol3-phosphate(G3P)followedbydephosphorylationofG3Ptoglycero1．FurtherstudieshadrevealedthatcytolNAD+一dependentglycerol3-phosphatedehydrogenase(ctGPD)istherate—limitingenzymesforglycerolsynthesis．However，itisunclearwhetherGPDhassimilarroleinCandidaglcerin

6、ogeneSWL2002—5，anovelosmotolerantyeastspeciesusedinglycerolproduction．So，itisessentialtocloneGPDgenefromC．glcerinogenes，forinvestigationofglycerolbiosynthesisinmolecularleve1．AftercomparisonoftheaminoacidsequenceoftheGPDHproteinsinseveralspecies，degenerateoli

7、gonucleoideprimersweredesignedforPCRbasedonconservativeregionsintheaminoacidsequence．PCRwasperformedonthegenomicDNAofC．gcerinogenesand收稿日期：2007—10—25．基金项目：国家自然科学基金项目(30570142)．作者简介：陈献忠(1980一)，男，安徽界首人，工业微生物博士研究生．*通讯作者：诸葛健(1939一)，男，浙江金华人，教授，博士生导师，主要从事发酵工程和工业微生物

8、学方面的研究Email：jianzhuge@hotmail．com维普资讯http://www.cqvip.com92食品与生物技术学报第27卷parametersinvolvedinamplificationefficiencywereoptimized．Usingonemoderatedegeneracypairofprimers，adegeneratePCRprod