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1、3-磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析食用菌@2011.18(2):5～9文章编号:1005—9873(2011)02—0005—05斑玉蕈甘油醛一3一磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析张津京.,陈辉,冯志勇,陈明杰,汪虹(农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海市农业科学院食用菌研究所,上海201403;南京农业大学生命科学学院,南京210095)摘要:甘油醛一3一磷酸脱氢酶(glyceraldehyde.3一phosphatedehydrogenase,GAPDH)是糖酵解和卡尔文循环中的关键酶,本实验室之前的研究发现斑玉
2、蕈菌丝的GAPDH表达随培养基中葡萄糖添加浓度的变化而变化,在此基础上我们首次克隆了斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,结果斑玉蕈基因长2724bp,对比基因组DNA和cDNA序列知其中有7个内含子,8个外显子;其理论分子量为36.15kD,编码蛋白质含338个氨基酸,等电点(PI)为8.24.关键词:斑玉蕈;甘油醛一3.磷酸脱氢酶;基因克隆;序列分析甘油醛.3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde一3一phosphatedehydrogenase,GAPDH)是糖酵解途径和葡萄糖异生作用过程中的一个关键酶基因,有较强的转录调控能力[1].同时GAPDH也是一种很重要
3、的抗逆境胁迫基因.HARRIS和WATERS[2]研究表明GAPDH可以大致分为烟酰胺结合区,催化区和S.1oop区.同时,0LSEN研究也表明甘油醛.3.磷酸脱氢酶的S.1oop区已经被证实非常重要,因为它包含一个疏水序列,是形成四聚体酶和重要离子与底物结合的核心.这个位点被证明在决定其热稳定性上也是至关重要的_4].还有研究表明在S.1oop区中有24个氨基酸(178.201aa),第183,185和195位的氨基酸影响着C.149和康宁木霉酸结合的活性,因此决定了GAPDH对抑制剂的敏感性[5-7_.斑玉蕈(HypsizysusmM口")又名玉蕈,真姬菇,蟹味菇等,是一
4、种珍稀食用菌,它隶属担子菌亚门,层菌纲,伞菌目,白蘑科,玉蕈属,自然分布于欧洲,北美,西伯利亚和日本等地_8].本实验室先前对斑玉蕈表达谱的研究表明,在不同葡萄糖浓度培养条件下该菌的菌丝和原基中甘油醛.3.磷酸脱氢酶表达量差异很大.目前斑玉蕈GAPDH基因尚无报道,为了深入研究GAPDH在斑玉蕈子实体发育过程中的作用,笔者分别克隆得到斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,并利用生物信息学方法对其编码区产物进行了预测和分析.1材料和方法1.1菌株和质粒斑玉蕈(H.marmoreus)菌株SIEF3133是由上海市农业科学院食用菌研究所保藏中心保藏;感受态细胞购自Tiangen
5、公司,质粒载体pGEM.Teasy购自TaKaRa公司.1.2试剂PCR试剂购自Takara公司,凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司,反转录PCR(RT.PCR)试剂盒购自TaKaRa公司,Redzol购自北京赛百盛基因技术有限公司,DEPC水购自BioBasicInc公司.1.3菌丝培养及DNA和RNA提取及cDNA的合成斑玉蕈菌丝在PDA培养基中培养大概15d长满平板后,将菌丝刮取于一70℃冷冻过夜,按参考文献E93的方法提取基因组DNA;总RNA收稿日期:2011—02—27原稿;2011—04—12修改稿基金项目:国家科技支撑计划项目(编号:2010BAK69B
6、18),上海科委科研平台建设专项(编号:09dz2200800),上海市科委崇明科技攻关专项(编号:10DZ1960100)的部分研究内容作者简介:张津京(1985一),女,2009级南京农业大学生命科学学院硕士研究生,主要从事食用菌的遗传与栽培的研究.本文通讯作者E-mail:fincbio@yahoo.com.cn食用菌第18卷提取采用Trizol法[1.单链cDNA的合成根据Takara反转录试剂盒说明书进行.1.4斑玉蕈gpd基因全长及cDNA序列的获得根据双色蜡蘑(Laccariabicolor,XM001887335),裂褶菌(Schizophyllumcommu
7、ne,XM003028287),香菇(Lentinulaedodes,AB012862)和金针菇(Flammulinavelutipes,AF515622)的gpd基因核苷酸序列进行同源性比对,选取高保守序列设计兼并引物进行巢式PCR.兼并引物序列分别为:gpdF1.GTTCAAGTAYGAYTCCGTCCA:gpdR1.TARCCCCACTCRTTGTCGTAC:gpdF2-CGAGTCHACBGGTGTYTTYAC:gpdR2-GGARACRASRBBGTCCTCDGT.PCR反应参数是:94℃预变
