直接发酵法生产L色氨酸的研究

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1、福建师范大学硕士学位论文直接发酵法生产L・色氨酸的研究姓名：李阳中请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：刘峰20090501中文摘要中文摘要本文以谷氨酸棒杆菌FC22为出发菌株，对直接发酵法生产I广色氨酸进行了研究。主要研究内容和结果如下：1.采用对二甲氨基苯甲醛比色法对发酵液中的L.色氨酸含量进行了定量分析。对比色法中影响【广色氨酸含量测定的因素进行了研究，并用单因素试验优化了实验条件，得岀了对二甲氨基苯甲醛比色法测定L.色氨酸含量的最佳检测条件，从而建立了快速测定发酵液屮I广色氨酸含量的方法。在最佳检测条件下，L色氨酸含量在0川1

2、50mg/L浓度范围内线性关系良好，回归方程为A593nm=0.0053C—0・0007,相关系数为R2=0.9975,冋收率为98・5%——99・O%。2.对出发菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)FC22的形态特征和生理特性进行初步鉴定和分析，对该菌株的发酵培养基配方及发酵条件进行研究，确定了发酵过程中影响L色氨酸积累的主要因素，从而为诱变育种的筛选工作做了准备。3・以谷氨酸棒状杆菌FC22(Phe'+Ty"+SMTR)为出发菌株，经紫外线(Uv)、硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理，并采用磺胺弧(

3、SG)、肉桂酸(C玳)作为抗性药物，通过摇瓶初筛和复筛、单菌落分纯以及连续传代试验测定，定向选育出一株遗传性状稳定的【广色氨酸高产菌株FC1013(Phe，+TyL+5MTR+SGR+CINR),在未经优化的发酵条件下摇瓶培养3天，平均可积累L。色氨酸8.91g/L,比岀发菌株FC22产量提高了120%。4・研究了菌株FC1013的摇瓶分批发酵条件。采用正交设计试验法优化了种子培养基组成配比；采用响应面分析试验法优化了发酵培养基组成配比；采用单因素试验优化了发酵培养条件。在优化条件下，菌株FC1013摇瓶发酵72小时,平均可积累L色氨酸

4、9.79g/L，比出发菌株FC22提高了141.7%。，关键词：谷氨酸棒状杆菌，I广色氨酸，检测，诱变育种，摇瓶发酵屮文文摘屮文文摘L色氨酸是具有卩引味基的中性芳香族氨基酸，是动物和一些真菌牛命活动中?甌範被帷#晒闵彼窗芳鹘谙懊庖叶5端鹘诘鞍字实暮铳桑谏镇宓男鲁麓弧⑸LQ5)杏兄匾饗谩S捎谄溢谑称贰(7)橇稀(14)揭「攘煩歟凶殴惴河猛竞途薮笫谐】占洌旳春芷卩票芯空叨浴竟闵彼岬纳辛松钊氟难芯俊？L.色氨酸早期采用蛋白质水解法和化学合成法来生产，现在主要采用微生物法来生产。微牛物法可分为酶促转化法和直接发酵法。酶促转化法牛产L一色氨酸的不

5、足是：色氨酸合成酶会受到底物口引卩朵的强烈抑制，甚至会完全失活；底物L.丝氨酸价格较高；卩引味水溶性较差，转化率不高。而直接发酵法可以利用L广色氨酸高产菌株,以廉价的葡萄糖、糖蜜等做原料，控制合适的培养条件，直接发酵积累L色氨酸。该法成本较低，工艺也较前两种简单。但由于【广色氨酸的生物合成途径比较长,代谢流比较微弱，且L—色氨酸牛物合成的共同途径和分支途径中的调节机制比较复杂，存在着多重反馈和弱化子系统调节作用，使得L色氨酸发酵生产成为氨基酸发酵工业中的难题之一。由于很难从自然界中找到能够大量积累【厂色氨酸的菌株，因此选育高产稳产的L色

6、氨酸优良菌种是直接发酵法成功的关键。目前我国市场上销售的L色氨酸主要依靠进口，我国国务院已于2004、2007年将L色氨酸牛产列入“鼓励外商投资产业目录"之中。直接发酵法生产L.色氨酸的研究，对发展我国氨基酸发酵工业具有重大的意义。本文对发酵液中I广色氨酸的快速测定、出发菌株的生理特征和产酸特性、L色氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化进行了重点研究。一、建立了快速测定发酵液中I广色氨酸含量的方法采用对二甲氨基苯甲醛比色法对发酵液屮的L色氨酸进行了定量分析。得出了对二甲氨基苯甲醛比色法测定发酵液中L_色氨酸含量的最佳检测方法：将发酵液30

7、00r/min离心10mi11,取上清液稀释适当倍数，准确取1mL稀释后的发酵液与9mL对二甲氨基苯甲醛储备液(3班)于试管中混合均匀后，60£水浴15min,加入0.5%亚硝酸钠溶液0.05mL,混匀后再继续60°C水浴5min,取出冷却并静置10min,以硫酸储备液做试剂空白(消除样品自身颜色的干扰)，用1em比色皿在593n1n波长处测定吸光值。当【广色氨酸在0150mg/L浓度范围内线性关系良好，回归方程为V福建师范大学李阳硕士学位论文A593nm0.0053C・0.0007,相关系数为R2——0・9975o用本法测定发酵液里的

8、L色氨酸含量，具有快速、简单易掌握、对仪器要求不高、结果重现性好以及准确度高等优点，适合发酵工业中L.色氨酸的快速分析。二、初步鉴定了岀发菌株FC22的生理特性和产酸特性通过生理试验，了解了出发菌株谷氨酸棒