细胞龛中造血干细胞和祖细胞的活体示踪

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1、活体动物位于其龛中的造血干细胞/祖细胞的追踪Abstract干细胞留驻在一个特化的，受调控的环境中，这个环境称为龛，龛控制着干细胞如何产生，维持及修复组织（1，2）。我们之前记录了移植的造血干细胞和祖细胞群局限在骨髓微血管的亚区域中，那里的化学因子CXCL12特别丰富（3）。将高精度共聚焦显微镜与双光子成像技术联合起来，持续观察活体小鼠颅盖骨骨髓的个体造血细胞，我们在受辐射及c-Kit-受体缺失容受小鼠中（recipientmice），检查了造血干细胞和祖细胞与血管，成骨细胞以及它们定居及移入的骨内膜表面之间的关系。成骨细胞陷入微

2、血管中，而干细胞/祖细胞在这个复杂组织中的相对位置不是随机的，并且是动态的。细胞自主因素和非自主因素都影响了细胞的原始局限化。不同的造血细胞亚群局限在完全不同的位置，这取决于分化的时期。当生理上的激发事件驱动细胞移入或扩张时，骨髓干细胞/祖细胞占据了（assumed）最接近骨和成骨细胞的位置。我们的分析使得我们可以在单细胞水平上实时观察某种过程，之前对这种过程只能在机体水平上研究其长期结果。哺乳动物干细胞龛在很大程度上是基于干细胞的局限化而被定义的，还有少数有限的定义是关于龛内异源细胞的，这种细胞调控干细胞的功能。还没有人在活体上

3、检查过这些龛的生理内容。造血干细胞（HSC）龛已经被研究过，办法是改变骨的组成部分，诱导干细胞功能的变化（4~7），或是通过免疫组化方式（8~10）。前者不能精确定义干细胞的局限化，后者则不能定义其功能。一些研究已经记录了成骨细胞在HSC命运上的调控作用（4，7，8，11~13）；但是，其它研究显示，从免疫表型上来说最像HSCs的那些细胞被观察到邻近于骨髓中的脉管系统（9）。骨髓脉管系统包括以有规律的间隔穿入密质骨的动脉，分叉成毛细血管覆盖中央窦（centralsinus）（14）。长骨的CD31免疫染色可以使人们观察到邻近骨内膜

4、表面的这种脉管网络，特别是骨小梁区域，这是已知的HSCs局限的地方（Fig.1aanddatanotshown）（7，10）。为了获得关于造血干细胞与祖细胞（HSPC）局限情况的更详细的，动态的视野，我们使用了活体显微观察，按4mm×6mm扫描小鼠颅盖骨，包括中央窦以及周围的骨髓腔（Fig.1b）（3）。这一区域HSC的出现频率可以与经免疫表型处理的长骨中的频率相比，并且具有重新填充的能力（SupplementaryFig.2c,d）。由于长骨的厚度阻止了活体显微技术的分析，我们无法确定我们的结果是否能扩展到长骨上，特别是较少骨小

5、梁的骨干区域。将共聚焦显微与双光子显微技术联合起来可以让我们观察深度达到~150μm，或者75%以上的经我们测量的骨中观察到40~60%的骨髓腔。通过第二倍频（SHG）显微技术（见Method），可以同时发现骨，成骨细胞，脉管系统，以及被标记的HSPCs，对成骨细胞限制纤维1α启动子（Col2.3-GFP）报导小鼠（15），在注射非靶向性量子原子团（Qdot655or800）后立即成像，然后用流式细胞术对染色的细胞进行分类，这些细胞分别是用亲脂性菁VybrantDiD（1,1′-dioctadecil-3,3,3′-tetrame

6、thylindodicarbocyanineperchlorate），或DiI（1,1′-dilinoleyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanineperchlorate）（Invitrogen，3）染色的（Fig.1d-h’SupplementaryFig.1andSupplementaryMovie1）。我们联合使用多种细胞表面标志物，以产出高度富集的长期重构HSC群体（LT-HSCs）（16，17）。LKS（即，lineagelow（Linlow），c-Kit（Kit）+以及Scal+）

7、CD34-Flk2-，LKSCD150+CD48-，以及LKSCD48-Flk2-细胞被分离出来，并代表了部分重叠的细胞群（SupplementaryFig.7）。GiventhatallflowcytometricmethodsofcellisolationcanonlyenrichforHSCs,wewillrefertoallthepopulationsusedashaematopoieticstem/progenitorcells(HSPCs)toaccountforanypotentialprogenitorcellco

8、ntamination.TheisolatedcellswerenotadverselyaffectedbyDiDstainingbasedoncompetitiveandserialreconstitutionassaysofirradiated