重组犬ifn-γ在原核细胞中的高效表达

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1、农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2005,13(5):639~643·研究论文·郅重组犬在大肠杆菌中的高效表达郅郅张海峰1李景荣2唐丽杰1范京惠1王玉玲1李一经1*郅(1.东北农业大学动物医学系，哈尔滨150030；2.黑龙江生物技术职业学院,哈尔滨150030)郅邾摘要：提取ConcavadinA诱导培养的犬脾细胞总RNA，经RT-PCR扩增出犬基因，克隆到pMD18-T载体并测序鉴定，然后把基因克隆到原核表达载体PJLA605，构建pRL-Ca

2、表达质粒；应用M9培养基通过摇瓶发酵，确定诱导时机和诱导表达时间。结果表明，工程菌pRL-CaI在30℃培养至600为1.5于42℃诱导4h，菌体收获量湿重达20.0g/L，目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的32%，外源基因在该基因工程菌中得到了高效表达。邾关键词：犬；高效表达；大肠杆菌郅郅HighExpressionofCanineRecombinantGenein郅121111ZHANGHai-FengLIJing-RongTANGLi-JieFANJing-HuiWANGYu-LingLIYi-J

3、ing*郅郅邾TotalRNAwasisolatedfromcaninespleencellsstimulatedwithConcavadinAandcaninegenewasamplifiedbyRT-PCR.TheamplifiedfragmentwasclonedintopMD18-Tvectorandsequenced,andthentheclonedgenewasinsertedintoexpressionvectorpJLA605.TherecombinaantplasmidofpRL-

4、Cawasconstructed.ThecellgrowthphasesforinductionandinducingperiodweredeterminedusingshakingflaskwithM9medium.Theresultsshowedthatwheninducedat42℃for4hafterthecultivationofDH5琢(pRL-Ca)inshakingflaskreachedto1.5(600)at30℃,20.0gofwetbacteriaperlitercouldb

5、eobtainedandthederivativeofCawasabout32%oftotalproteininthehost.Thegenewashighlyexpressedintheengineeringbacterialstrain.邾canine；highexpression；郅干扰素(IFN)是由脊椎动物细胞产生的一类分隆了犬cDNA，并用pRc/CMV2表达载体在泌型糖蛋白，它具有广谱抗病毒和增强免疫应答的鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)中进行了表达。邾作用(Minagawa.，1999)。

6、干扰素可分为玉型和近年来，养犬业在我国发展十分迅速，犬的种类域型，域型干扰素又称为干扰素酌(IFN-酌)或免疫干和数量也越来越多。而疾病尤其是病毒病却严重危++扰素，主要由抗原刺激CD4和CD8T细胞所产生，害着犬的健康与生存。为了研制和开发犬重组干扰在免疫应答中十分重要(Pinelli.，1999)。邾素类生物制品，本研究克隆了犬cDNA，并采20世纪80年代初，人的干扰素基因克隆成功用PJLA605表达载体，通过优化表达条件，使外源后(Gray.，1982)，各国学者相继开展了动物干扰基因在该工

7、程菌中得到了高效表达，为应用犬重组素的研究。Hiummler等(1987)首先开始了犬干扰素提供了基本资料。郅基因的研究。Zucker等(1992)克隆了犬基因1材料和方法郅并在中国地鼠卵巢细胞(CHO)中进行了表达。Akira等(1996)克隆了犬基因。夏春等(1999)克隆报1.1质粒、菌株和培养基邾道过德国牧羊犬基因序列，杨琪等(2002)克宿主大肠杆菌()DH5琢和质粒张海峰：1977年生，男，硕士研究生。E-mail：.郅*通讯作者。Authorf

8、orcorrespondence.E-mail：.郅收稿日期：2004-08-20接受日期：2004-11-03PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建www.fineprint.cn640农业生物技术学报2005年PJLA605由本实验室保藏。LB为基础培养基，M9为h，至600值约为0.6。郅表达培养基(具体配方参见《分子克隆》第三版)。郅1.3.3诱导表达根据文献和初步研究结果确定1.2表达质粒的构建郅以L