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1、重组人肝刺激物在原核细胞中的表达与纯化 摘要：利用基因重组技术,构建成人肝刺激因子(hHSS)和谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体,转化大肠杆菌BL-21(DE3),以His·Tag亲和层析纯化表达产物,factorXa切割分离hHSS单体,并检测其生物学活性。结果显示,在pET-42a表达体系中hHSS以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,gST-hHSS表达量占菌体可溶性蛋白的30%;FactorXa切割GST与hHSS之间肽腱,得到33和15kD两条蛋白带,经TT法[8]观察重组hHSS促细胞增殖状况。人肝癌细胞系BEL-7402以含10
2、%胎牛血清(HyClone)的DMEM(GIBCO/BRL)培养基培养,按1×104/ml细胞密度接种于96孔培养板,于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞完全贴壁后,换用无血清DMEM培养基(内含10 μg/ml胰岛素)培养12h。将终浓度为0、160、240、320、400 ng/ml的重组hHSS加入培养基,孵育24h后用六孔重复测定其促细胞增殖活性。另设空白对照,只加等体积培养基,但不含重组hHSS。每孔加入20μl MTT溶液(5 mg/ml,北京华美生物工程公司)继续孵育4h。以酶标仪(Microplatereader550,B
3、io-Rad)测定490nm波长处各孔的吸光值。 2结果 2.1含hHSS基因转化细胞的筛选 从pUC18-hHSS酶切得到hHSScDNA,应用Glassmilk回收纯化后,正向插入pET-42a的EcoRⅠ和SalⅠ位点。通过卡那霉素筛选,pCR扩增确证hHSS基因正确连接于pET-42a,并成功转化到BL-21细菌中。 2.2GST-hHSS融合蛋白表达形式及含量的测定 不同克隆菌株以IPTG诱导GST-hHSS融合蛋白的表达。诱导后融合蛋白表达量明显高于诱导前水平,不同克隆间融合蛋白的表达量也不尽一致,说明相同条件下各转化细菌
4、间融合蛋白的表达效率差异较大。挑选hHSS高表达克隆菌的诱导前细菌总蛋白、诱导后培养液上清、诱导后细菌胞浆可溶性蛋白和包涵体蛋白进行SDS-PAGE。 2.3GST-hHSS融合蛋白的酶切纯化及活性分析 用FactorXa缓冲液过夜透析融合蛋白后以不同浓度酶切分析,结果如图3所示。在33和15kD处有两条明显的染色条带,分别与GST蛋白和hHSS蛋白的分子量一致。如未经透析处理,则FactorXa的切割效率显著降低。为进一步验证GST-hHSS融合蛋白,以l的刺激下,BEL-7402细胞的增殖加快,并呈现出剂量-效应反应。在400 ng/m
5、l作用24h后,hHSS刺激组细胞OD490值较对照组升高34%,统计学分析表明两组数值具有显著性差异(P＜0.01),提示重组HSS表现出明显促细胞增殖活性。 3讨论 利用DNA重组技术生产用传统方法难以获得的生物活性分子,是近年分子医学和医药工程的热点研究课题。我们曾进行hHSS基因原核表达的研究,并获得rhHSS,但多以不溶性包涵体形式存在。从包涵体中进行蛋白复性,只有少部分蛋白得以复性,具有活性功能。复性过程是否会影响rhHSS的构象还无法确定。以融合蛋白的形式表达目的蛋白,可增加外源蛋白可溶性和稳定性。通过His·Tag亲和层析方
6、法纯化目的蛋白,有利于提高重组蛋白的产量和纯度。以GST融合蛋白技术表达外源基因已有研究[10～13],但有关GST-hHSS表达、纯化及酶切分离方面尚未见报道。本研究发现,人肝刺激因子不仅以包涵体形式,还以可溶性蛋白形式存在于细菌中。实验表明,gST-hHSS占可溶性蛋白含量的30%,纯化后GST-hHSS的浓度可达2.6 mg/ml。提取和纯化可溶性GST-hHSS融合蛋白,避免了变性-复性等复杂步骤,减少了对蛋白构象的影响,增加了蛋白的稳定性[14]。FactorXa切割GST-hHSS融合蛋白可获得hHSS单体。Factorxa活性受离
7、子浓度、pH值、温度、时间、变性剂、酶用量及蛋白质本身属性等多种因素影响。本实验证实,经过酶切缓冲液透析这一简单步骤处理,可明显提高FactorXa切割GST-hHSS的效果,对这一改进还未见到有关报道。 本实验首次报道重组hHSS融合蛋白的表达和纯化,并通过对rhHSS活性初步检测,证明重组hHSS具有促肝癌细胞BEL-7402生长的作用,为进一步研究基因重组HSS的功能和作用机制提供了物质基础。 参考
