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《重组人转化生长因子β1在chodhfr~-细胞中的稳定表达和纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、重组人转化生长因子β1在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达和纯化刘春凤1，张宁2，周婷2，王世媛2，陈清西*1(1.厦门大学生命科学学院，福建厦门361005；2.厦门特宝生物工程股份有限公司，福建厦门361022)摘要：构建含重组人转化生长因子β1基因的真核表达载体，并利用阳离子脂质体介导方法，将构建的表达载体转染到二氢叶酸还原酶缺陷型哺乳动物细胞CHO/dhfr-中，通过MTX加压筛选获得稳定表达重组人转化生长因子β1的细胞株．于14L细胞发酵罐进行扩大培养，通过ELISA检测其表达量，表达量
2、在3mg/L左右．采用亲和层析、反相层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化，通过本纯化工艺获得的rhTGF-β1试制品的纯度大于97%，得率在25%以上．通过MALDI-TOFMS质谱测定rhTGF-β1的分子量为25470Da，与理论分子量一致．N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列，测序结果与理论的氨基酸序列一致．重组人转化生长因子β1具有抑制水貂肺上皮细胞Mv-1-Lu增殖的活性，测定rhTGF-β1的活性为3.2×107IU/mg，比活与R&DrhTGF-β1标准品相当．本研究为进一步规模化制
3、备生长重组人转化生长因子β1鉴定基础．关键词：重组人转化生长因子β1；表达；纯化中图分类号：Q356．1文献标识码：A收稿日期：2015-01-09基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划），课题编号2007AA021604*通信作者：chenqx@xmu.edu.cn11转化生长因子β（Transforminggrowthfactors-β）是一类具有多种生物学活性的细胞因子，参与调节细胞的增殖、分化、发育和凋亡等多种生命活动[[]LawrenceDA.Latent-TGF-beta:ano
4、verview[J].MolCellBiochem.2001,219:163–170.]．TGF-β亚家族目前报道有6种，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5和TGF-β6，它们氨基酸序列之间有70%～80%的同源性[[]GovindenR,BhoolaKD,Genealogyexpression,andcellularfunctionoftransforminggrowthfactor-beta[J].PharmacolTher.2003,98:257–26
5、5.]．哺乳动物仅有3种，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们位于不同的染色体上，其中TGF-β1在体细胞系中所占比例最高(>90%)，活性最强．TGF-β1在人体的多项生理过程中发挥着重要的作用，各种实验表明它能够有效抑制多类细胞的增殖，参与了肿瘤发生发展、免疫反应、创伤修复以及细胞间质的形成等各种生理过程[[]Abou-ShadyM,FriessH,ZimmerhammA,etal.Connectivetissuegrowthfactorinhumanlivercirrhosi
6、s[J].Liver.2007,20(2):296-304.]．特别在肝脏纤维化时肝实质细胞、非实质细胞如HSC、Kupffer及窦周细胞是TGF-β1的主要产生细胞[[]LewindonPJ,PereiraTN,HoskinsAC,etal.Theroleofhepaticsatellitecellsandtransforminggrowthfactor-1incysticfibrosisliverdisease[J].AmJPathol.2008,160(5):1705-1715.]．在大多数
7、细胞中，未成熟的TGF-β1由390个氨基酸组成，在胞内蛋白内切酶的作用下，N-端278个氨基酸形成前导肽，C-端112个氨基酸为成熟肽（图1）．TGF-β1成熟肽具有9个高度保守的半胱氨酸残基，其中8个半胱氨酸残基相互靠近，形成链内二硫键，第9个半胱氨酸形成链间二硫键，将两个单体联结在一起，构成具有生物学活性的二聚体．前导肽与成熟肽被切开后仍以非共价的形式结合，形成一种与受体不能结合的潜在复合物，需通过改变离子强度和pH进行分离，分离后的成熟肽才具有活性[[]KhalilN.TGF-beta:f
8、romlatenttoactive[J].MicrobesInfect.1999,1:1255–1263.[6]ZhongchengZou,PeterDS.Overexpressionofhumantransforminggrowthfactor-β1usingarecombinantCHOcellexpressionsystem[J].ProteinExpressionandPurification.2004,37:265-272.[7]MadisenL,LioubinMN,Ma
