核酸分离纯化_经典版

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1、核酸的分离纯化技术核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。概述一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性1.意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。2.实验过程中，应注意以下条件及要求：1）减少化学因素对核酸的降解:pH4-102）减少物理因素对核酸的机械剪切力：0-4C强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的

2、线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。（一）保持核酸分子一级结构的完整性3）抑制DNase或RNase的活性：所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。4）简化步骤，缩短时间，减少破坏。（一）保持核酸分子一级结构的完整性3.DNA酶抑制剂(1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+等

3、离子。(2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。（一）保持核酸分子一级结构的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。(1)皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。（一）保持核酸分子一级结构的完整性(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋

4、白变性。使用注意：DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。剧毒。（一）保持核酸分子一级结构的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制剂（3)肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)4.RNA酶（RNAase)抑制剂（一）保持核酸分子一级结构的完整性一、核酸分离、纯化原则(二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度纯化的

5、核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。破碎组织细胞提取纯化I.材料与方法的选择II.破碎细胞或包膜－核酸的释放III.核酸分离、纯化IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质V.核酸的鉴定与保存二、分离提取核酸的主要步骤临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；应

6、选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。（一）材料与方法的选择临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。（一）材料与方法的选择DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。（二）细胞的破碎——核酸的释放破碎细胞的方法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法

7、、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞，SDS可溶解细胞膜、核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与DNA分离；③酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸分离。（二）细胞的破碎——核酸的释放注意：1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的提取；2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。（二）细胞的破碎——核酸的释放细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核