多肽与蛋白质的提取与分离

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1、关键词：多肽蛋白质提取分离摘要：多肽是由多个氨基酸缩合形成的，蛋白质是由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接的多肽链，随肽数目，氨基酸组成及排列顺序不同，蛋白质分子呈现三维空间结构，并且有生物活性。采取何种分离方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。㈠﹑多肽的提取与分离多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方

2、向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。相1.　高效液色谱（HPLC）　　HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其他化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如赵骏①等以酪蛋白为原料，采

3、用微生物蛋白酶A水解，其酶解产物为血管紧张素转化酶（ACE）。2.反相高效液相色谱（RP-HPLC）.用反相色谱法分离多肽和蛋白质的原理是基于蛋白质的疏水性，在不同介质条件下，使不同的蛋白质得以分离，具有快速高效和高回收的特点，在分离和制备多肽及蛋白质上有独特的优越性。吴亚丽②等利用反相高效液相色谱法分析降血压肽AHP的最佳工艺条件。3.　疏水作用色谱(Hydrophobicinteractionchromatography,HIC)　　HIC是利用多肽中含有疏水基团，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-HPLC具有较少使多肽变性的特点。利

4、用HIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比RP-HPLC分离的要稳定，活性较稳定。Geng等利用HIC柱的低变性特点，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ，通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子（EGF）也利用HIC纯化到了，均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能达到这一要求。 4.分子排阻色谱(Size-Exclusionchromatography,SEC)　　SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便。如人重组生长激素（h

5、GH)的分离，不同结构、构型的GH在SEC柱上的分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体。利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法，此PEG具有半衰期长、作用强的特点。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。5.离子交换色谱(Iron-Exchangechromatography,IEXC)　　IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质

6、、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐酶异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。6.膜蛋白色谱(ChromatographyofMembraneProtein,CMP)　　CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决

7、定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。7.高效置换色谱(High-PerformanceDisplacementChromatography,HPDC)　　HPDC是利用小分子的高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离目的。它具有分离组分含量较少成分的特性。利用HPDC鉴定分离了低于总量1％组分的活性人重组生长激素(rHG)。㈡﹑蛋白质的提取与分离蛋白质种类很多，性质差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同

8、，使用方法差别也很大，且