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1、第45卷增刊厦门大学学报(自然科学版)Vol.45Sup.2006年5月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)May2006优化海兔肝蛋白质组提取与分离技术3李志丹,包晓东,黄慧英,黄河清(厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术学系,福建厦门361005)摘要:为了提高海兔肝脏蛋白质组的提取及研究效率,本文描述和比较了3种提取海兔肝脏蛋白质组的方法:裂解液浸泡-超速离心,丙酮-TCA沉淀-裂解液浸泡,裂解液浸泡-丙酮-TCA-裂解液溶解.然后采用常规SDS2PAGE双向电泳对提取出的蛋白质进行检验,用Melanie4Trial软件分析电泳图谱,通过对
2、蛋白质分辨率和斑点总数的比较,选出一种更适合海兔肝蛋白质的提取方法.结果表明采用丙酮-TCA沉淀-裂解液浸泡法提取海兔肝蛋白质所得的双向电泳图谱不论从蛋白质斑点分辨率还是总数上都优于其他两种方法,更适合提取分离海兔肝脏蛋白质.关键词:海兔肝;SDS2PAGE双向电泳;提取与分离;优化分离;蛋白质组中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号:043820479(2006)S20194204海兔(Aplysia)系杂食性动物,属软体动物门腹足1.1材料与试剂纲(Gastropoda)后腮亚纲(Opisho2branchia)海兔科NLCS取材于厦门浅海区域.分离海兔肝蛋白质(Aplysiidae)动
3、物,广泛分布在热带及亚热带海域,以组所需要的试剂和配方参考常规的SDS2PAGE双向电底栖矽藻和沉积在海滩上的有机质、绿藻和底栖桡足[2,3]泳技术,但进行适当优化.类等为食.海兔系雌雄同体的海洋软体动物,它在我国丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷福建、广东、山东等省的海域均有分布.厦门最常见的(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)、超纯尿素(urea)、NONIDE2海兔品种是蓝斑背肛海兔(NotarchusleachiicirrosusTP240(NP240)、CHAPS均购自上海生工;载体两性电Stimpson,NLCS).现在海兔已经成为生物研究的一种介质(pH3～9,pH5～8,p
4、H4～6)购自北京军事医学模式生物,尤其是在神经节蛋白质组的研究上.经国内科学院;胰蛋白酶(V5111)购自Promega公司;SDS分外各大数据库检索后,发现有关海兔肝的蛋白质组学子量标准购自Fermentas公司;α2氰242羟肉桂酸(HC2研究尚未见详细报道.由于海兔肝脏中蛋白质种类相CA)购自美国ICN生物医学公司.对较少,更适合开展肝脏蛋白质组学研究.本次实验以1.2分离蛋白质组的基本仪器设备建立海兔蛋白质组学数据库为目标,对海兔肝的蛋白双向电泳槽:DYCZ226型多用途电泳槽,北京六一质组学进行系列研究.近期,基质辅助激光解吸离子化仪器厂;垂直电泳槽:DYCZ224型,DYCZ22
5、4A型,北京飞行时间(Matrix2assistedlaserdeposition/ionization[1]六一仪器厂;水平脱色摇床:WD29405B型,北京六一time2of2flight,MALDI2TOF)质谱技术已用于分析软仪器厂,沃德生物医学仪器公司;SCP55H超速冷冻离体动物和足类动物的神经功能多肽种类和结构,表现心机:Hitachi,日本.出高灵敏度、超微量和快速等特点.优化蛋白质组分离方法是开展蛋白质组学最基本实验步骤之一.本论文1.3溶液的配制[4]探讨海兔肝蛋白质组的提取与分离方法,阐明海兔肝(1)样品裂解液:7mol/L尿素,4%CHAPS,2蛋白质种类与分布情况,其
6、技术可为今后深入开展软mol/L硫脲,60mmol/LDTT,10mmol/LTris,1mmol/L体动物肝脏蛋白质组学研究提供可行性技术.EDTA,1mmol/LPMSF,0.5%CA,0.0002%溴酚蓝).分装,-20℃保存待用.1材料与方法(2)有机溶剂提取液(10%TCA/丙酮):称10gTCA,加100mL丙酮溶解,-20℃保存待用.(3)平衡液:50mmol/LTris2HClpH8.8、6mol/L收稿日期:2005212225尿素、30%甘油、2%SDS,-20℃保存.使用前10mL基金项目:福建省自然科学基金(C0310006)和厦门大学预研基金平衡液存储液加100mgD
7、TT.(2004xdcx207;XDKJCX20051009)资助作者简介:李志丹(1983-),男,硕士研究生.(4)SDS分离胶缓冲液:1.5mol/LTris2HCl(pH3通讯作者:hqhuang@xmu.edu.cn8.8)、0.4%SDS的水溶液.增刊李志丹等:优化海兔肝蛋白质组提取与分离技术·195·(5)SDS浓缩胶缓冲液:0.5mol/LTris2HCl(pHV,30min;3)
