融合蛋白招标签

《融合蛋白招标签》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。  如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，

2、科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结

3、构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一

4、类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。短肽标签：His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：（1）位于目标蛋白Ｎ端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；（2）His标签几乎..不影响目标蛋白的理化性质；（3）His标签很小，不会改变目标蛋白的可溶性；（4）His标签在目标蛋白结晶后对蛋白结构几乎没有影响；（5）采用固定化金属离子亲

5、和层析纯化His标签融合蛋白时，其操作非常简便。基于上述优点，几乎所有的大型结构基因组研究中心都把纯化His标签融合蛋白的固定化金属离子亲和层析（immobilizedmetal-ionaffinitychromatography，IMAC）作为主要的蛋白纯化方法。  然而，并不是所有的蛋白质都可以与His标签融合后，采用固定化金属离子亲和层析分离纯化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然发生的组氨酸丰富区域，在固定化金属离子亲和层析时可能会导致其他蛋白的非特异性结合；目标蛋白含有金属离子，一般也不采用His标签与固定化

6、金属离子亲和层析。 FLAG-tag：除了His标签外，另一个广泛使用的小分子短肽标签是FLAG标签。FLAG标签是由8个氨基酸（DYKDDDDK）组成的一个短肽，分子量很小，因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。该标签具有天然的亲水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗体检测；同时含有一个肠激酶切割位点（DDDK），可以利用肠激酶切除标签。FLAG标签有3个特异性的单克隆抗体，分别为M1单抗、M2单抗、M5单抗。FLAG短肽合成成本较高，不适用于大规模纯化，且

7、需要额外步骤除去结合在层析介质上的短肽。Strep-tagⅡ：与His-tag、FLAG-tag相似，Strep-tagⅡ也是一个小分子的短肽标签，广泛用于多种目标蛋白在原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统等的表达与纯化中。在自然界中，链霉亲和素（streptavidin）与生物素（biotin）之间存在着非常强烈的非共价相互作用，其生物学上的解离常数极低；即使生物素与其他蛋白质共价结合之后，两者仍可以相互作用。基于这两者之间的强烈相互作用，运用一系列蛋白质工程手段，通过对短肽文库的筛选，第一个链霉亲和素结合肽应运

8、而生，即Strep-tag，极大地方便了重组蛋白的一步快速亲和纯化。然而，Strep-tag与链霉亲和素结合时需要一个自由的羧基末端，因而该标签只能位于目标蛋白的C端，限制了它的应用范围。在Strep-tag的基础上，通过对合成短肽的筛选，获得了一个与其相似、由８个氨基酸（WSHPQFEK）组成的链霉亲和素结合肽，即Strep-tagⅡ，可以位于融合蛋白的任意位置，从而弥