高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究

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1、高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究＿答辩人：李文＿石峰田实验方案通过改变培养基中激素的浓度、配比和糖浓度等对蝴蝶兰顶芽、花梗节间等外植体进行组织培养快速繁殖试管苗，培育出愈伤组织诱导频率高、再生频率高的植株体系。蝴蝶兰组织培养成功后，我们将用秋水仙素对其进行处理，培育多倍体蝴蝶兰。技术路线母株选择→初代诱导→丛芽分化→继代增殖→壮苗生根→锻炼幼苗→出瓶移栽实验方案表格如下图所示：MS（加Vc,椰汁）NAA(mg/l)6-BA(mg/l)(1)(2)(1)(2)花梗节间44花粉块1155幼叶112020茎尖1155根尖1010VW（加Vc,椰汁）NAA(mg/l)6

2、-BA(mg/l)(1)(2)(1)(2)花梗节间44花粉块1155幼叶112020茎尖1155根尖1010项目研究进展情况(08-3-12------08-4-4)总进度：正在进行愈伤组织的诱导，观察，分离和筛选阶段。分进度：第一阶段：召开开题报告会，小组讨论会议，确定实验如何开展。第二阶段：相关文献、资料的搜集，培养基的选择实验材料的挑选。第三阶段：母液、培养基的配制、灭菌、倒板，材料的预处理（4℃,24h）、购买。无毒处理、接种。第四阶段：接种外植体后进行培养（25℃，黑暗培养），观察，记录褐变、污染情况，并设计相应的解决方案。第五阶段：吸取经验，重复实验，进

3、行新方法的测试与应用。进展结果茎尖和根尖很容易长霉，而花粉块和花梗节间很少被污染。褐化的外植体也基本是茎尖和根尖，因为这些外植体细胞分裂比较活跃，多酚氧化酶的活性也相对要高些，因此容易褐化。部分外植体褐变、霉变，其余外植体形态、颜色与接种前相比无明显变化目前存在的问题问题一：霉变——①消毒不彻底。②超净工作台操作不严格。③无菌操作意识不足。④封装保存不完善。问题二：褐变——外植体切割后，内部细胞与外界空气直接接触，组织中多酚氧化酶被激活，多酚类化合物和单宁被氧化后产生醌类物质的缘故。①切割面过大，外植体被损伤。②接种方向不对，应使切割面接触培养基。③外植体过于老化。④初代

4、培养中培养基中无机盐和植物生长调节物质浓度过高。问题三：材料来源——长沙无蝴蝶兰培养基地，市场上销售的蝴蝶兰为观赏用花，不能作为理想的实验材料，因此接种后脱分化、再分化的效果不好。解决方案①增强无菌操作的意识②活性炭能有效控制褐化和促进生长,但不利于分化;谷胱甘肽控制褐化的效果虽不及活性炭,但综合效果最佳。因此可在培养基中加入这些抗氧化物质，以防止外植体的褐化。③选择幼嫩的实验材料，有利于外植体脱分化及愈伤组织的诱导。④总结上次实验经验，确定合适的无机盐、琼脂和植物生长调节物质的浓度。下阶段计划及主要措施计划：①总结经验后，决定用花梗节间和花粉块两种外植体继续培养、诱导愈

5、伤组织，并控制培养条件，如加入活性碳等，以防止褐化。②利用蝴蝶兰种子培育出蝴蝶兰试管苗，此试管苗幼嫩，可作为理想的实验材料进行组织培养。措施：第一步：搜集蝴蝶兰种子培养基的相关文献资料，了解其萌发条件，萌发周期，萌发所需培养基。第二步：利用种子培养基对种子接种，并添加一些生长调节物，如香蕉汁等，探索缩短种子萌发的因素。第三步：待种子萌发后，按规范的组织培养操作方法，进行外植体的接种。第四步：所用外植体为3～4片叶试管苗的顶部两片叶。将叶片切成约1cm见方接种于不同的培养基上,每次处理10瓶,每瓶接种4块,叶片正面向上。培养室温度(25±1)℃,光照强度约1500lx(光源

6、为40W日光灯),光照时间12h/d。第五步：待叶片表面出现芽点状突起时,制作常规石蜡切片,切片厚度8μm,番红、固绿染色,光学显微镜下拍照。接种后50d统计胚状体或愈伤组织发生情况。形成率=形成胚状体块数/接种外植体总块数。预期成果〈一〉通过向培养基中加入活性碳等抗氧化剂，防止外植体褐化。选择激素的最适浓度配比，添加适宜的生长调节物，如椰汁等，培养出愈伤组织诱导频率高，再生频率高的植株体系，达到加快繁殖速度的效果，使蝴蝶兰繁殖成本降低，以提高经济效益。〈二〉由蝴蝶兰种子萌发的蝴蝶兰试管苗，取其幼叶为外植体（该外植体幼嫩，是理想的实验材料），进行组织培养，以期获得再生频率

7、高的植株体系。〈三〉将无菌操作贯穿在整个实验过程中,尽量防止外植体的霉变、褐变、染菌,提高实验的成功率。〈四〉用秋水仙素处理再生的植株体系,以期得到目前未报道，具更高观赏价值的多倍体蝴蝶兰。第二阶段进展报告(08-5-12)用三个品种的蝴蝶兰种子培养,得到三种蝴蝶兰无菌试管苗.(1)其幼叶因为幼嫩,可作为下一阶段的外植体,进行愈伤组织的诱导,并继续探索提高蝴蝶兰离体培养成功率的条件.(2)可直接用秋水仙素处理无菌试管苗,得到多倍体蝴蝶兰,探索其观赏价值,遗传学特征等.蝴蝶兰种子培养出的试管苗第二阶段小结完成情况:2,3号种子有