shRNA沉默IRS_1基因对鼠前脂肪细胞分化和PPAR_表达的影响

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1、·596·检验医学2010年8月第25卷第8期LaboratoryMedicine，August2010，Vol25．No8．文章编号:1673-8640(2010)08-0596-05中图分类号:R446．1文献标识码:AshRNA沉默IRS-1基因对鼠前脂肪细胞分化和PPARγ表达的影响112唐玲丽，唐爱国，周后德(1．中南大学湘雅二医院检验科，湖南长沙410011;2．中南大学湘雅二医院内分泌研究所，湖南长沙410011)摘要:目的观察胰岛素受体底物-1(IRS-1)基因表达受阻对小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化和脂质过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的影响。方法针对小鼠IRS

2、-1基因开放阅读框上的2个区域合成短发夹核糖核酸［shRNA(M和MH)］，以pGenesil-1vector为载体构建带绿色荧光蛋白(GFP)靶标的shRNA质粒。以TM脂质体Lipofectamin2000介导转染3T3-L1前脂肪细胞，并设阴性对照(HK)载体转染组。细胞转染后，G418筛－6选稳定表达的阳性克隆并通过免疫印迹法鉴定。应用0．5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10mol/L地塞米松(DEX)和5μg/mL胰岛素(Ins)分别诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞空白对照组、HK载体转染组、M和MH转染组分化，在诱导分化的不同时间点收集细胞。用免疫印迹法检测PP

3、ARγ的表达。脂肪细胞内脂滴用油红O染色观察。结果与空白对照组、HK组和转染M组IRS-1shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞相比，转染MH组IRS-1shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞IRS-1蛋白表达水平降低70%以上;而MH转染组细胞PPARγ蛋白的表达与前3组3T3-L1前脂肪细胞比较无改变。前3组3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞成功，PPARγ蛋白的表达在脂肪细胞分化成熟过程中逐渐增高。油红O染色显示，随着脂肪细胞的分化成熟，桔红色脂滴逐渐增多;而转染MH组IRS-1shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞经诱导，油红O染色桔红色脂滴显着减少，直到分化的第8天，才见少

4、许桔红色脂滴，且PPARγ蛋白的表达无变化。结论IRS-1基因沉默后可抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，并在分化过程中抑制PPARγ的表达，说明IRS-1通过调节PPARγ的表达或与PPARγ共同作用在3T3-L1前脂肪细胞的分化中发挥决定性作用。关键词:胰岛素受体底物-1;脂质过氧化物酶体增殖物激活受体γ;RNA干扰;3T3-L1前脂肪细胞TheinfluenceofshRNAsilencingIRS-1geneonthedifferentiationofmousepreadipocytesandPPARγ112expressionTANGLingli，TANGAiguo，ZHOUHoude

5、．(1．DepartmentofClinicalLaboratory，theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity，HunanChangsha410011，China;2．InstituteofMetabolismandEndocrinology，theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity，HunanChangsha410011，China)Abstract:ObjectiveToobservetheinfluenceofinsulinreceptorsubstrate-1(IRS-1)g

6、enesilencingonthedifferentiationofmouse3T3-L1preadipocytesandperoxisomeproliferator-activatedreceptorγ(PPARγ)expression．MethodsTwoshorthairpinRNA(shRNAMandshRNAMH)targettoIRS-1genecodingregionweredesignedandclonedintopGenesil-1-shRNAvectorwithgreenfluorescenceprotein(GFP)tag．ThepGenesil-1-IRS-1-shRN

7、ATMplasmidswerestablytransfectedinto3T3-L1preadipocytesbyLipofectamin2000，andnegativecontroltransfectedgroup(HK)wasset．ThepositivecloneswerescreenedbyG418andidentifiedthroughmeasuringIRS-1proteinby－6W