疫组织化学医学医药资料

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1、免疫组织化学的双重或多重标记要求：1.掌握IHC多重标记染色的基本原理和技术要求2.了解常用方法类型及其优缺点概述应用IHC的方法在同一张组织切片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，即谓双重或多重免疫标记。显示的水平可以是光镜，也可以是电镜常用方法类型有：按标记物分：免疫荧光双重标记(FITC-TRITC)，免疫酶双重标记(单酶双底物-HRP:DAB与4CN/H2O2);AP:萘酚AS-MX/坚固红与坚固蓝；双酶双底物(HRP与AP，DAB/H2O2与萘酚AS-MX/坚固红)；免疫胶体金标记(5nm与15nm)。按标

2、记抗体分：直接、间接法、复合物法等按抗体制备动物来源分：异种动物抗体法与同种动物抗体法。按有否洗脱去除第一重抗原抗体复合物分：洗脱法与非洗脱法。一般多采用荧光或酶标间接法，混合试剂，不洗脱，光镜以双荧光或双底物酶标记为多，颜色区别。电镜以胶体金不同直径颗粒(5nm与15nm)标记为多，颗粒大小区别。一、基本原理双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位标记两种或两种以上抗原抗体复合物，达到在同一细胞或亚细胞水平显示不同抗原成分(

3、定性、定位、定量)，分析不同抗原成分相互间的功能关系，操作遵循的原则与要求同单标免疫组化方法。为了避免前重免疫标记与后重标记的交叉、重叠，其间可采用酸洗破坏(洗脱法)或饱和封闭(非洗脱法)加以克服。二、光镜下的多重免疫标记染色（一）双重免疫荧光标记染色采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素(FITC)呈绿色与罗丹明(RB200)或异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈红色。技术方

4、法敏感、特异，需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样本不能长期保存。技术类型：有直接法和间接法之分。前者特异、快速，后者敏感、多用。所用抗体试剂可为异种动物抗体，也可为同种动物抗体。异种动物抗体常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低。同种动物抗体多分别应用，操作步骤加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理。操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH双重免疫荧光标记染色（间接法）(1)石蜡切片，厚5µm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4,0.01m

5、ol/L)。(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min（亦可用10％正常羊血清代之），不洗。(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育30min37℃，湿盒。(4)0.05mol/LTBS(pH7.4,内含1％Triten×100,下同)洗，10min×3。(5)羊抗鼠IgG-TRITC1:100，湿盒，室温避光反应1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3，(第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。(7)切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放

6、在80℃烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。(8)切片以TBS洗，5min×4(9)1％HSA（或10％正羊血清）孵育30min，室温，湿盒，不洗。(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min，37℃，湿盒。(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3(12)羊抗鼠IgG-FITC1:100,湿盒，室温避光反应1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3(第二重GH-FITC标记染色完成)。(14)缓冲甘油封片。(15)荧光显微

7、镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察切片组织内TRITC及FITC所标示的ACTH及GH抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）。(16)用彩色底片对切片同一部位用546nm及490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的ACTH与GH两种抗原。TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游离FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被灭活图1同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理二、多重免疫酶标记染色以酶催化

8、不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。在光镜下可以同时观察和对比，样品保存时间相对较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。★常用标记酶与底物的配伍单酶双底物--HRP--DAB(棕色):4CN(蓝色)AEC(红色):4CN(蓝