《疫组织化学技术》PPT课件

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1、免疫组织化学技术Immunohistochemistry,IHCImmunocytochemistry,ICC基本原理利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。免疫酶技术显示Caspase-3免疫荧光技术显示MOR抗原：可被T、B细胞识别，并启动特异性免疫应答的物质。即抗原可作用于T、B细胞的抗原识别受体，促使其增殖、分化，产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）并与之结合，从而发挥免疫效应。抗原的两种特性：免疫原性：即能刺激机体产生

2、免疫应答（产生特异性抗体或致敏T细胞）；抗原性：指能与其所诱生的抗体或致敏T细胞特异性结合。完全抗原：同时具备免疫原性和抗原性半抗原：只具备抗原性而不具备免疫原性抗原决定簇或表位：决定抗原特异性的基本结构或化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。抗原分子表面能够与抗体结合的表位数量称为抗原的价，完全抗原一般均为多价。共同抗原：两种不同的抗原分子所具有的相同或相似的抗原决定簇称为共同抗原或共同决定簇。亲缘关系很近的生物之间的共同抗原称为类属抗原；抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原的反应称为交叉反应。影响免疫原性的因素：1.理化特性（大分子蛋白质可含有大量不同的抗

3、原决定簇，是强免疫原；多糖是重要的天然抗原，如细菌内毒素脂多糖、血型抗原；核酸多无免疫原性，但与蛋白结合形成核蛋白则有免疫原性；多肽类激素如胰岛素也有免疫原性）、分子量（抗原的分子量一般≥10kD，且分子量越大，免疫原性越强）、结构的复杂性（免疫原性物质还须具备复杂的化学组成与特殊的化学基团，如含大量芳香族氨基酸）、分子构象和抗原决定簇的易接近性等。2.宿主方面的因素：异种性（“非已”－－异种、同种异体、自体抗原－－抗原来源与宿主关系越远，免疫原性越强）、遗传因素（个体差异）、年龄、性别与健康状态。3.抗原进入机体的方式：抗原的剂量（低剂量和高剂量都不易引起免

4、疫应答）、进入机体的途径（皮内＞皮下＞肌肉＞腹腔＞静脉）、免疫次数（强的免疫应答需要多次注射）、佐剂（可先于抗原或同时与抗原混合注射动物，以增强抗原的免疫原性，即起辅佐抗原作用的物质，如弗氏佐剂）。抗体（antibody,Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞——浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavychain,H）和两条相同的轻链（lightchain,L）借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很

5、大，为可变区（variableregion,V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constantregion,C）。Fab即抗原结合片段（fragmentantigenbinding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即可结晶片段（fragmentcrystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。用木瓜

6、蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。PcAb特异性差，易出现交叉反应。由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的

7、浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学直接法：用酶或其他标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色产物，沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。TissueAntigenLabeledAntibody间接法：第一抗体不标记，使

8、用与第一抗体种属相同的抗体Fc段（有种